La autocompatibilidad en el almendro(Prunus amygdalus Batsch): estructura genética del alelo Sf y modificaciones de su expresión

Abstract

L'ametller, Prunus amygdalus Batsch, és una espècie diploide que pertany al gènere Prunus. Encara que l'autoincompatibilitat (AI) és un caràcter important des del punt de vista evolutiu en el món vegetal, l'autocompatibilitat (AC) és un caràcter agronòmic crític per a assegurar la producció. D'aquesta manera, l'AC s'ha convertit en un dels principals objectius dels programes de millora d'ametller en tot el món. L'AC ha estat identificada en diverses varietats d'ametller, encara que sol ser excepcional. Els mètodes que s'han aplicat per a determinar l'AC són l'observació dels tubs pol·línics, i el quallat de fruits després de pol·linitzacions controlades. No obstant això, les noves tècniques moleculars s'han aplicat cada vegada més al llarg de les dues últimes dècades. Amb això s'ha aconseguit de determinar el genotip de les varietats i seleccions d'una manera molt ràpida i eficaç. L'AC ha estat relacionada amb la presència de l'al·lel Sf, el qual pertany a la sèrie al·lèlica S, i és dominant sobre els altres al·lels d'AI. Com a conseqüència d'això, sempre s'havia considerat que l'AI/AC era un caràcter qualitatiu, controlat per un únic locus, anomenat el locus S.<br/>Només un 25% dels individus procedents de l'encreuament 'Vivot' &#1048751; 'Blanquerna' ha estat AC, molt menys de l'esperat, un 50%. Les dues versions diferents de l'haplotip Sf, una activa i AI (Sfa) i l'altra inactiva i AC (Sfi), han mostrat el reconeixement per part de la Sfa- RNasa dels pistils de 'Vivot' dels tubs pol·línics amb el Sfi de 'Blanquerna'. Aquests resultats suggereixen la presència d'un locus modificador no lligat al locus S, el qual seria el responsable del control de l'AI/AC en aquesta població. Encara que darrerament s'hagi aprofundit en l'estudi del locus S a nivell molecular, aquest mecanisme no està encara del tot determinat, pel que se suggereix que d'altres gens serien un requisit per a l'AI. En aquesta tesi s'ha localitzat per primera vegada en la família de les rosàcies dos nous loci, situats fora del locus S, els quals es troben en els grups de lligament 6 i 8. Amb aquests resultats, podríem suggerir que l'AI és un caràcter quantitatiu i no qualitatiu, com s'acceptava fins ara.<br/>D'altra banda, la construcció d'una llibreria genòmica (fòsmid) de 'Vivot' i 'Blanquerna' ens ha permès de comprovar que tant les Sf-RNases com les SFBf eren completament idèntiques, a pesar de tenir dues expressions tan diferents. Com no ha estat possible de trobar cap mutació entre ambdós Sf, s'ha suggerit la implicació de la metilació de l'ADN en aquesta població. La metilació pot produir canvis en els fenotips o en l'expressió els gens, sense alterar però les seqüències de l'ADN. Els assaigs realitzats en aquesta tesi suggereixen que l'ADN metilat seria el responsable d'aquesta activació i/o inactivació de l'haplotip Sf. De fet, s'ha pogut comprovar que quan la seqüència de la Sf-RNasa és metilada, aquesta inactiva l'expressió, així que aquesta inhibició es traduiria en una expressió AC, com és el cas de 'Blanquerna'. En el cas contrari, si la seqüència d'ADN no és metilada, com és el cas de 'Vivot', la RNasa roman activa i a conseqüència la planta és AI.<br/>A més, s'ha construït l'estructura en 3D de les RNases dels a&#320;lels Sf, S23 i S8 mitjançant tècniques bioinformàtiques. La principal diferència trobada ha estat que en l'estructura del Sf hi havia un llaç més llarg que en les altres dues RNases AI. En la bibliografia s'ha descrit que els llaços grans són susceptibles a la degradació proteòlica, pel que aquest mateix fenomen podria passar en aquestes RNases.

El almendro, Prunus amygdalus Batsch, es una especie diploide que pertenece al género Prunus. Aunque la autoincompatibilidad (AI) es un carácter importante en el reino vegetal desde el punto de vista evolutivo, la autocompatibilidad (AC) es un caràcter agronómico muy crítico para asegurar la producción. De este modo, la AC se ha convertido en uno de los principales objetivos de los programas de mejora de almendro en todo el mundo. <br/>Aunque la AC ha sido identificada en algunas variedades de almendro, es muy poco frecuente.<br/>Los métodos que se han utilizado para determinar la AC en el almendro son la observación de los tubos polínicos y el cuajado de frutos después de polinizaciones controladas. Sin embargo, las nuevas técnicas moleculares se han ido aplicando cada vez más durante estas dos últimas décadas. De este modo, se ha conseguido determinar el genotipo de las variedades y selecciones de una manera muy rápida y eficaz. La AC ha sido relacionada con la presencia del alelo Sf, el cual pertenece a la serie alélica S, y es dominante sobre los otros alelos de AI.<br/>Por ello siempre se había considerado que la AI/AC era un carácter cualitativo. En el transcurso de esta tesis, sólo un 25% de los individuos procedentes del cruzamiento 'Vivot' &#1048751; 'Blanquerna' ha sido AC, mucho menos de lo esperado, un 50%. Las dos diferentes versiones del haplotipo Sf, una activa y AI (Sfa) y la otra inactiva y AC (Sfi) han mostrado un mutuo reconocimiento, por lo que la Sfa-RNasa del estilo de 'Vivot' ha impedido el crecimiento del tubo polínico Sfi de 'Blanquerna'. Estos resultados sugieren la presencia de un locus modificador no ligado al locus S, el cual sería responsable del control de la AI/AC en esta población. Aunque últimamente se ha profundizado mucho en el estudio del locus S a nivel molecular, su mecanismo de acción sigue sin estar del todo determinado, por lo que se sugiere que otros genes externos son necesarios en la AI. En esta tesis se han localizado por primera vez en la familia de las rosáceas dos nuevos loci situados fuera del locus S, los cuales se encuentran en el grupo 6 y 8. Con estos resultados, podríamos sugerir que la AI es un<br/>carácter cuantitativo y no cualitativo, como se conocía hasta la fecha.<br/>Por otro lado, la construcción de una librería genómica (fósmido) en 'Vivot' y 'Blanquerna' ha permitido comprobar que tanto las secuencias de las Sf-RNasas como de los SFBf eran completamente idénticas, a pesar de tener dos expresiones tan distintas. Como no ha sido posible encontrar ninguna mutación entre ambos Sf, se ha sugerido la implicación de la metilación del ADN en esta población. La metilación puede producir cambios en los fenotipos o en la expresión de los genes sin alterar las secuencias del ADN. Los ensayos llevados a cabo en esta tesis sugieren que el ADN metilado sería el responsable de la activación y/o inactivación del haplotipo Sf. De hecho, se ha podido comprobar que cuando la secuencia de la<br/>Sf-RNasa es metilada, ésta inactiva la expresión, por lo que esta inhibición se traduciría en una<br/>expresión AC, como es el caso de 'Blanquerna'. En el caso contrario, si la secuencia de ADN no es metilada, como es el caso de 'Vivot', la RNasa permanece activa y a consecuencia la planta será AI.<br/>Además, se ha construido la estructura en 3D de las RNasas de los alelos Sf, S23 y S8 mediante herramientas bioinformáticas. La principal diferencia encontrada fue que en la estructura del Sf, había un lazo más largo que en las otras dos RNasas AI. En la bibliografía se ha descrito que los lazos grandes son susceptibles a la degradación proteólica, por lo que este mismo fenómeno podría estar pasando en estas RNasas.

Almond, Prunus amygdalus Batsch, is a diploid species of the genus Prunus. Although self-incompatibility (SI) is an important trait in plants from the evolutionary point of view, self-compatibility (SC) is a critical agronomic trait in order to ensure the production of an economic crop. Thus, SC has become one of the main objectives worldwide of almond breeding programmes. SC has been identified in several almond cultivars, although it happens rarely. Traditionally tests of pollen tube growth and fruit set after controlled pollinations have been carried out for determining SC cultivars in almond. However, molecular methods have been developed in the last two decades to speed up the genotype determination in cultivars and selections in order to facilitate orchard management and breeding processes. SC has been so<br/>far only related with the presence of the Sf allele, allelic with the S series of SI alleles and dominant over SI. As a consequence, SC/SI has always been considered as a qualitative trait,<br/>controlled by a single multi-allelic locus, called the S-locus.<br/>The presence of SC of the seedling in the family 'Vivot' &#1048751; 'Blanquerna' has been 25%, much less than expected, 50%. The two different versions of the Sf haplotype, one active and being SI (Sfa) and the other inactive thus being SC (Sfi), have shown the recognition of the Sfi-pollen tubes of 'Blanquerna' by the Sfa-RNase of 'Vivot'. These results suggest the presence of a modifier locus unlinked to the S-locus which would control the SI/SC recognition mechanism. The molecular nature of the S-locus has been widely studied in many species. Although the S-locus encodes genes determining the S-specificity, other non-Sspecific genes or modifier genes are required for the S-RNase-based SI reaction. Two additional loci located outside the S-locus are here described for the first time in the rosaceous family. Thus, we may suggest that SI is a quantitative trait rather than a qualitative one.<br/>In addition, the construction of a fosmid library in 'Vivot' and 'Blanquerna' has allowed to confirm that the alignment of their Sf-RNases and SFBf were identical. As it was not possible to find any difference between both versions of the Sf haplotype, it was decided to further investigate about DNA methylation, which is involved in changes in phenotype or gene expression caused by mechanisms other than changes in the DNA sequence. Thus, our experiments have allowed suggesting that DNA methylation could be responsible of the activation/inactivation of the Sf haplotype. In fact, when the Sf-RNase sequence is methylated,<br/>an inhibition of the expression takes place, as it happens in 'Blanquerna'. Thus, this nactivation would be traduced into self-compatibility. In the case of Sf-RNase sequences with non-methylated cytosines, as it happens in 'Vivot', the RNase would remain active and, as a consequence, it would be self-incompatible.<br/>On the other hand, we have constructed the three-dimensional structures of the almond Sf, S23 and S8 RNases trough molecular modelling tools. The main structural difference found between all RNases was that the Sf structure showed an extended looping region. The amino acid residues forming this long loop could be prone to degradation and/or inactivation and as a<br/>consequence this Sf-RNase could be less stable and thus would allow its pollen tube growth<br/>trough its own pistil.