Identificació i caracterització dels enzims implicats en la biosíntesi i degradació de feromones en lepidòpters nocturns

Abstract

El conjunt de treballs duts a terme en aquesta tesi tenen per objectiu aprofundir en els mecanismes bioquímics de la comunicació feromonal dels insectes, agafant com a model els lepidòpters nocturns i estudiant-ne tant els aspectes que concerneixen la biosíntesi de llurs feromones com els relacionats amb la seva detecció. Tot i que ambdós processos (biosíntesi i detecció) estan estretament relacionats, s'ha considerat convenient dividir la tesi en dos capítols diferenciats. Així, després d'una introducció general i un capítol de metodologia comú, es presenta un primer capítol destinat a l'estudi d'enzims biosintètics i un segon destinat a l'estudi dels enzims responsables del metabolisme de la feromona un cop aquesta ha activat el receptor olfactiu.

Els treballs duts a terme en el primer capítol formen part de la participació del grup en el projecte “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contracte EC: FP6-032275). L'objectiu del projecte era el disseny i implementació d'un dispositiu artificial capaç de mimetitzar la comunicació química dels insectes, agafant com a organisme model l'arna S. littoralis. La participació del nostre grup en el projecte es va centrar en el disseny i la implementació del dispositiu emissor, que pretenia reproduir una part de la ruta biosintètica de la feromona mitjançant la immobilització dels enzims biosintètics en un microreactor. Més enllà d'aquest propòsit, però, es va considerar interessant identificar els ortòlegs de l'insecte utilitzat com a model, la “S. littoralis”, i estudiar la seva influència en la proporció final dels compostos feromonals. Dels enzims de la ruta biosintètica que han estat postulats com a principals responsables de la proporció dels compostos feromonals, la reductasa d'àcids grassos i l'alcohol acetil transferasa no havien estat encara identificats en “S. littoralis” i se'n disposava d'escassa informació en altres insectes. Per aquest motiu es va considerar interessant centrar l'atenció en aquests dos enzims, que d'altra banda eren també els més rellevants per a l'assoliment dels objectius del projecte iCHEM.

En el segon capítol es descriuen els treballs duts a terme amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les esterases antenals de lepidòpters nocturns, potencialment implicades en la finalització de l'estímul provocat per la feromona. Per a la realització d'aquests estudis es van escollir dues arnes de la família “Noctuidae”. La primera d'elles, “S. nonagrioides”, constitueix una important plaga dels conreus del blat de moro. La utilització d'inhibidors d'esterases havia resultat prometedora en assajos “in vitro” utilitzant homogeneïtzats de l'antena, així com en assajos d'electrofisiologia duts a terme pel grup (Quero et al. 2003; Quero et al. 2004), però l'absència d'una major informació sobre els enzims diana limitava la millora i optimització d'aquestes molècules amb activitat inhibidora. Pel que fa a la segona espècie escollida (“S. littoralis"), a més de constituir una important plaga arreu del món, oferia l'avantatge de poder ésser criada fàcilment en captivitat, així com el fet de disposar d'abundant informació sobre la seva biologia. Les tasques d'identificació i caracterització d'esterases en les dues espècies es va dur a terme en paral•lel, però degut a les diferències en la quantitat d'informació disponible sobre les dues arnes, es va considerar interessant utilitzar estratègies diferents per a cada insecte.

The set of works presented in this thesis aim to deepen the biochemistry of pheromone communication in insects, taking the moth as a model and investigating the biochemistry aspects of both pheromone biosynthesis and pheromone degradation. Although biosynthesis and degradation are closely related in pheromone biology, the thesis has been divided in two different chapters, the first one concerning the enzymes involved in pheromone biosynthesis and the second one concerning the antennal esterases, involved in pheromone degradation of many moth species.

The tasks carried out in the first chapter were part of the European project “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contract EC: FP6-032275). The main role of our group in the iCHEM project was the implementation of an artificial pheromone emitter, that attempted to reproduce part of the biosynthetic route of the pheromone through the immobilization of biosynthetic enzymes in a microreactor. However, beyond this aim, it was considered to be interesting the identification of the orthologues enzymes of “S. littoralis”, and to study the influence of these enzymes in the final proportion of the pheromonal compounds. To this end, the most interesting enzymes of the biosynthetic pathway were selected for DNA isolation, recombinant expression of the protein and biochemical characterisation of the obtained enzyme.

The second chapter describes the work carried out in order to deepen the knowledge of antennal esterases of moth, potentially involved in the termination of the stimulus caused by the pheromone. To this end, two moths of Noctuidae family were chosen. The first one, “Sesamia nonagrioides”, is an important pest of corn crops. The use of inhibitors of esterases had promising results “in vitro” assays previously performed using antenna homogenized, however the absence of further information on the target enzymes limited the improvement and optimization of these molecules with inhibitory activity. The second chosen species, “S. littoralis”, besides being a major pest worldwide, offered the advantage of being easily raised in captivity and the availability of abundant information about its biology. The tasks of identification and characterization of esterases in the two species was carried out in parallel, but due to the differences in the information available about two moths, it was considered interesting to use different strategies for each insect.