Ecología de levaduras: Selección y adaptación a fermentaciones vínicas

Abstract

This thesis had two different parts: Yeast ecology and selection and adaptive mechanisms for fermentations at low temperatures.<br/>The aim of the first part was to study the yeast ecology of two Spanish wine regions (Terra Alta and Priorat). This study was used to select some yeasts for fermentation starters.<br/>This study confirmed that non-Saccharomyces species were limited to early stages of the fermentation, being the main species Candida stellata, whilst Saccharomyces dominated towards the end of fermentation. This study presented a large variability of Saccharomyces strains (a total of 112, all of them identified as S. cerevisiae). A classic selection with this high number of strains would have been very time-consuming. Thus, we used two criteria: massive competence during fermentation, to analyse the imposition of a strain over similar ones, and fermentation temperature. The temperature clearly determines the fermentation kinetics, the development of the Saccharomyces strains and the characteristics of the final wine.<br/>The selected strains were tested in cellars of both wine regions and as consequence, strain RV1 was selected to be sold commercially for the elaboration of red wines with high ethanol content.<br/>The aim of the second part was to study the effect of low temperature (13&#61616;C) on the cell membrane fatty acid composition, production of volatile compounds and intracellular evolution of some metabolites (sugars, organic acids.)<br/>The optimal membrane fluidity at low temperature was modulated by changes in the unsaturation degree in S. cerevisiae. In S. bayanus, however, the change in the unsaturated fatty acid percentage was not observed at different growth temperatures but the percentage of medium-chain fatty acids at low temperatures was higher. Anyway, more strains should be tested to make any conclusion.<br/>In the study of intracellular metabolites, we observed that citric acid was the main intracellular acid in the middle stages of fermentation. However, tartaric acid, which was practically undetectable until mid fermentation, was clearly accumulated in the latter stages of the process. This accumulation was unexpected because this acid was not metabolised by S. cerevisiae.<br/>Further studies about the effect of the organic acids on the alcoholic fermentation were done. The most important result was that in a defined medium with ammonium sulphate as nitrogen source, an organic acid was necessary in order to prevent stuck fermentations. The effect of these acids on the fermentation seems to be not only related to its buffering capacity, but to the role of these acids inside the cells that remains unclear yet. Also, it is not known how these acids cross the membrane, although our results suggested a regulated transport.<br/>If instead ammonium, amino acids are used as nitrogen source, the fermentation finished without problems in absence of organic acids and the acidification of the media was lower. This lower acidification by amino acids was caused by a different transport mechanism of these compounds inside the cells. The nitrogen source also influences the cell fatty acid composition and the production of volatile compounds.

Esta tesis consta de dos partes bien diferenciadas: una primera parte de Ecología y selección de levaduras y una segunda parte de Mecanismos de adaptación a bajas temperaturas.<br/>La primera parte consistía en realizar un estudio ecológico de dos zonas vitivinícolas de la provincia de Tarragona, las Denominaciones de Origen (D.O.) Terra Alta y Priorat como paso previo para una posterior selección de levaduras para su utilización como iniciadores de fermentación en procesos industriales en estas dos D.O.s o en fermentaciones con características similares. <br/>En este estudio ecológico, la especie mayoritaria durante los primeros días de fermentación fue Candida stellata, pero a partir del 3er o 4º día, como era de esperar, se impusieron las cepas de Saccharomyces. La variabilidad de cepas de Saccharomyces detectada fue muy elevada, ya que se identificaron 112 cepas diferentes de Saccharomyces cerevisiae entre las dos D.O.s. A causa de la gran variabilidad obtenida, como criterios de selección se utilizaron principalmente dos: fermentaciones masivas por competencia, es decir, capacidad de imposición de unas cepas sobre otras similares, y la temperatura de fermentación. La temperatura se eligió porque se trata de una variable que influye de forma muy clara en la cinética de fermentación, en la imposición de las cepas de Saccharomyces y en el producto final.<br/>Con las cepas seleccionadas se hicieron pruebas de fermentación en bodega. A partir de las cuales, la Universidad Rovira i Virgili registró una cepa, que posteriormente ha sido comercializada por la empresa Lallemand como RV1, seleccionada para la elaboración de vinos tintos con elevado grado alcohólico.<br/>En la segunda parte se estudiaba el efecto de la bajas temperaturas (13&#61616;C) sobre la composición de ácidos grasos de membrana, la producción de compuestos volátiles y la evolución intracelular de algunos metabolitos (azúcares y ácidos orgánicos). <br/>La óptima fluidez de la membrana a bajas temperaturas por parte de las células parece mantenerse de forma diferente por las especies de Saccharomyces. Mientras las cepas de Saccharomyces cerevisiae mantienen un grado de insaturación mayor, la cepa de Saccharomyces bayanus aumenta su porcentaje de ácidos grasos de cadena media. Más cepas de ambas especies deberían estudiarse para sacar conclusiones definitivas.<br/>En el estudio de los metabolitos intracelulares, por su parte, se observó que hasta mitad de fermentación el ácido mayoritario en el interior de la célula era el ácido cítrico mientras que a final de fermentación era el ácido tartárico. Este último dato era interesante porque el ácido tartárico es un ácido que no es utilizado por Saccharomyces.<br/>Estudios más exhaustivos sobre el efecto de los ácidos orgánicos en la fermentación alcohólica se realizaron, en los que se observó que en un medio definido en el que la fuente de nitrógeno era sulfato amónico, se necesitaba un ácido orgánico para evitar una parada de fermentación. El efecto de estos ácidos en el buen funcionamiento del proceso parece no estar únicamente relacionado con su capacidad de tamponante. De todas maneras, los otros beneficios ocasionados por los ácidos orgánicos a la célula nos son actualmente desconocidos, así como si Saccharomyces regula el transporte del ácido tartárico, aunque nuestros resultados apuntan hacia esta posibilidad. <br/>En cambio, si la fuente de nitrógeno son aminoácidos en lugar de amonio, la fermentación finaliza sin problemas en ausencia de ácidos orgánicos y la acidificación producida en el medio es menor. La causa de esta menor acidificación hay que buscarla en el transporte de ambas especies al interior de la célula. La fuente de nitrógeno también tiene una gran influencia en la composición de ácidos grasos de membrana, así como en la producción de compuestos volátiles.