Adaptation and development of culture-independent techniques for the indentification and enumeration of microorganisms in wine fermentations

Abstract

L'objectiu d'aquesta tesi va ser l'adaptació i validació de diferents tècniques independents de cultiu per a la detecció i quantificació de la microbiota present a la fermentació vínica. Es van assajar la QPCR (PCR quantitativa) per a la quantificació i seguiment d'espècies clau i la diversitat ecològica es va analitzar per DGGE (electroforesi en gel desnaturalitzant) i la clonació d'un fragment ribosomal.<br/>Tanmateix es va estudiar l'aplicació de la Hibridació in Situ (FISH) i la QPCR amb colorants específics per tal de diferenciar cèl·lules vives i mortes. <br/>Aquestes tècniques es varen aplicar a fermentacions industrials, essent notable la detecció de bacteris acètics i llevats No-Saccharomyces en concentracions superiors a les detectades com a poblacions cultivables. Es van estudiar interaccions entre llevats Saccharomyces i No-Saccharomyces al laboratori, observant-ne la supervivència d'aquestes en estats viables però no cultivables. <br/>Aquestes tècniques independents de cultiu indiquen una població i dinàmiques microbianes prèviament desapercebudes.

The objective of this thesis was the adaptation and validation of different culture-independent techniques for detection and quantification of the microbiota present in wine fermentation. We tested the QPCR (PCR quantitative) for the quantification and monitoring of key species. The ecological diversity was analyzed by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) and by cloning of a ribosomal fragment. <br/>However, we studied the application of in Situ Hybridization (FISH) and QPCR with specific dyes to differentiate between live and dead cells. <br/>These techniques were applied in industrial fermentations, being significant the detection of acetic acid bacteria and Non-Saccharomyces yeast in concentrations higher than those identified as culturable populations. We studied the interactions between Saccharomyces and Non-Saccharomyces yeast in the laboratory, observing their survival in these viable but non-culturable state. <br/>These culture-independent techniques indicate a population and microbial dynamics previously unnoticed.