Estudio estructural y funcional de proteínas de movimiento viral de virus de plantas.

Abstract

Los virus de plantas para extender la infección necesitan, en su movimiento célula-célula, atravesar la barrera que supone la pared celular, para lo cual aprovechan los plasmodésmos (PD). Éstos son aperturas en la pared celular atravesadas por un canal membranoso (desmotúbulo) que permiten el intercambio de agua, nutrientes y moléculas de señalización. En el caso de los virus de RNA de polaridad positiva la entrada de la partícula viral en la planta provoca el desensamblaje de la cubierta. Proceso ligado al inicio de la transcripción de las primeras proteínas virales, implicadas en la replicación del genoma viral. A continuación se sintetizan el resto de proteínas del virus entre ellas las encargadas de transportar el RNA viral de una célula a la célula adyacente, conocidas como proteínas de movimiento (MP). Estas proteínas son imprescindibles para el transporte del genoma del virus, en un primer lugar al PD (empleando la red de membranas derivadas del retículo endoplasmático (ER)) y a continuación a través de éstos; en este caso necesariamente en intensa interacción con el desmotúbulo. <br/><br/> Los virus de plantas se agrupan en tres grandes categorías según el número de MP que presenten, así encontramos aquellos que presentan una única MP de gran tamaño (la superfamilia 30k), otro gran grupo conocido como DGB (double gene block) con dos pequeñas MP y por último el TGB (triple gene block) con tres MP. La relación entre las membranas de la planta y las MP es imprescindible para el transporte del genoma viral pero únicamente ha sido estudiada en profundidad en el caso del TGB. Es por esto que en la presente tesis se planteó el estudio del tipo de interacción establecida entre la membrana y las MP del los virus MNSV y TCV ambos del DGB y PNRSV y TMV (pertenecientes a la superfamilia 30k). Para lo cual se emplearon métodos bioquímicos de transcripción y traducción in vitro en presencia de microsomas y diferentes técnicas biofísicas como dicroísmo circular o la balanza de Langmuir así como ensayos in vivo tanto en E.coli como en N.bentamiana. <br/><br/>El MNSV tiene dos MP, una soluble y capaz de unir RNA (p7A), la otra p7B presenta una única región hidrofóbica (RH) entre los aminoácidos 13 y 32 identificada por los programas de predicción empleados como un fragmento transmembrana (fTM). Dicha región es capaz de insertarse en membranas del ER. Es además capaz de dirigir e insertar la proteína en la membrana de manera cotraduccional. p7B adopta tanto en membranas del ER como en E.coli una topología N-t citosólico/C-t extracelular. La MP p9 del TCV al igual que p7B se inserta de manera cotraduccional en membranas del ER, donde adopta una topología N-t citosólico/C-t luminal determinada por su único fTM (residuos 3-20).<br/><br/>La MP del PNRSV, p30 presenta una RH incapaz de insertarse en la membrana. La proteína si se asocia a las membranas aunque de manera periférica no de manera integral. Su dominio hidrofóbico (aa 89-110) es probablemente responsable de esta interacción y juega un papel fundamental en la capacidad de la proteína para transportar el RNA viral de una célula a otra. La prolina 96 (en la RH) además de determinar la estructura de este dominio es imprescindible para la correcta función de la proteína. La MP del TMV p30, ha sido considerada hasta la fecha como una proteína integral de membrana. Los estudios realizados en esta tesis demuestran que si bien si se asocia a la bicapa lipídica no lo hace de manera integral sino más bien periféricamente, análogamente a p32.

The cell-to-cell movement of RNA plant virus require the function of the so-called movement proteins (MP). These proteins interact with the plasmodesmata, an aperture in the plant cell wall crossed by a membranous channel formed by prolongations of the Endoplasmatic Reticulum (ER), to facilitate the passage of the viral RNA from one cell to the next one. The interaction of the MP with the ER has been reported for several MP in different stages of the infectious process, but the nature of this association has only been fully studied in few cases. To gain further knowledge of the infection process we have examined the type of association of three different MP, p7B (MNSV), p9 (TCV), p30 (TMV) and p32 (PNRSV) with membranes derived from the ER. In this study we have use a broad range of biochemical techniques, from in vitro transcription and translation to circular dichroism, monolayer studies and membrane isolation from plant tissue. The experimental approach was supplemented with a computer-assisted analysis of the MP sequences. <br/><br/>In this work we have found that p7B inserts into the membrane in a co-translational manner using its hydrophobic region (aminoacids 13-32) as a signal sequence and as a stop transfer sequence. The N-t of the protein faces the cytosol while the C-t its located within the lumen of the ER. p9 from TCV is also a Type II integral membrane protein with just one transmembrane region (aminoacids 3-20). <br/><br/>The MP from PNRSV has one hydrophobic region (aminoacids 89-110), which it is not capable of being inserted into microsomal membranes by the translocon machinery. In despite of not being transmembrane this segment seems to be essential for the membrane association of the MP and for the cell-to-cell RNA transport shown by p32. Our results indicate that p30 is not integral membrane proteins but a membrane associated protein.<br/><br/>It seems that the association of MP to membranes it is necessary for the infectious process, although plant virus have evolve different strategies to accomplish this task.