Changes in the HIV-1 env gene: Implications at the RNA and protein structure levels

Abstract

La glicoproteïna de l’envolta (Env) és una de les proteïnes claus del VIH-1 en patogènesi. La seqüència del gen env és important per a codificar l’Env però també per les estructures secundàries dels RREs que contenen els seus trànscrits. La rellevància dels dos elements s’ha comprovat extensament, tot i que assajos funcionals són requerits en ambdós casos per estudiar l’impacte de canvis específics. El tractament amb l’inhibidor de fusió T-20 selecciona virus resistents després d’adquirir canvis al gen env. Per estudiar variants funcionalment rellevants d’env que es trobessin in vivo vam decidir utilitzar mutacions associades a T-20. Les prediccions de les estructures secundàries dels RRE van resultar alterades en els canvis que codificaven per G36V/D, V38A, Q40H i L45M, però no per N43D o Q40H-L45M. Funcionalment vam demostrar que només els mutants que presenten el canvi L45M a la seva seqüència pateixen un impacte en la capacitat d’unir-se a la proteïna viral Rev quan aquesta es troba en baixes concentracions, suggerint que els canvis nucleotídics que afecten a la formació de l’aminoàcid 45 de gp41 juguen un paper en la unió a Rev. De totes maneres, ninguna variant d’RRE va ser afectada en la seva capacitat per a ser transportada al citoplasma. Per tant, alteracions en les prediccions d’estructures secundàries a partir de seqüències nucleotídiques no necessàriament impliquen impactes funcionals i la mutació L45M no s’incorpora com a mutació secundària degut a un restaurament de les funcions del RRE. Com que és important caracteritzar funcionalment Envs derivades de pacients per a estudiar la seva patogenicitat, vam establir una metodologia completa per a estudiar-les basant-nos en el paper principal que hi juga la subunitat gp41. Els resultats demostren que la selecció de la línia cel·lular efectora és essencial per optimitzar la sensibilitat dels assajos. La línia cel·lular 293T hauria de ser utilitzada per experiments fusogènics i la HeLa per analitzar paràmetres relacionats amb la mort. Estudis clínics havien suggerit que virus que contenien la mutació V38A i que havien aparegut sota un context que tinguessin el polimorfisme viral N140I eren menys patogènics degut a que estaven associats amb fallada virològica i beneficis immunològics. Per tal d’entendre aquestes dades discordants vam basar-nos en la nostra metodologia per a analitzar Envs derivades de pacients que tinguessin aquests canvis. Aquestes Envs V38A-N140I van resultar tenir menys capacitat per induir la mort per cèl·lula individual tot i no veure’s alterada la seva capacitat fusogènica, remarcant la importància del context de l’Env i el paper central de gp41 a la patogènesi del VIH-1.

La glicoproteína de la envuelta (Env) es una de les proteínas claves del VIH-1 en patogénesis. La secuencia del gen env es importante para codificar la Env pero también para las estructuras secundarias de los RREs presentes en sus tránscritos. La relevancia de estos dos elementos ha sido comprobada extensamente, pese a que ensayos funcionales aún son requeridos en ambos casos para estudiar el impacto de cambios específicos. El tratamiento con el inhibidor de fusión T-20 selecciona virus resistentes después de adquirir cambios en el gen env. Para estudiar variantes funcionalmente relevantes de env que se encontraran in vivo decidimos utilizar mutaciones asociadas a T-20. Las predicciones de las estructuras secundarias de los RRE resultaron alteradas en los cambios que codificaban para G36V/D, V38A, Q40H y L45M, pero no para N43D o Q40H-L45M. Funcionalmente demostramos que sólo los mutantes que presentan el cambio L45M en su secuencia sufren un impacto de unión a la proteína viral Rev cuando ésta se encuentra en bajas concentraciones, sugiriendo que los cambios nucleotídicos que afectan a la formación del aminoácido 45 de gp41 juegan un papel en la unión a Rev. No obstante, la capacidad de transporte al citoplasma de estos RRE no está afectada. Por lo tanto, alteraciones en las estructuras secundarias predictivas a partir de secuencias nucleotídicas no necesariamente implican impactos funcionales y la mutación L45M tampoco se incorpora como mutación secundaria debido a la restauración de las funciones del RRE. Como es importante caracterizar funcionalmente Envs derivadas de pacientes para estudiar su patogenicidad, establecimos una metodología completa basándonos en el papel principal de la subunidad gp41. Los resultados demostraron que la línea celular efectora es esencial para optimizar la sensibilidad de los ensayos. La línea celular 293T debería utilizarse para experimentos de fusión y la HeLa per analizar parámetros de citopaticidad. Estudios clínicos habían sugerido que virus que contenían la mutación V38A y el polimorfismo viral N140I estaban asociados a una fallo virológico y beneficios inmunológicos del paciente debido a que eran menos patogénicos. Para entender estos datos discordantes analizamos Envs derivadas de pacientes y vimos que cuando éstas tenían los cambios V38A-N140I tenían menos capacidad para matar células diana de forma individual pese a no tener alterada su capacidad fusogénica. Estos datos remarcan la importancia del contexto de la Env y el papel central de gp41 en la patogénesis del VIH-1.

The Env glycoprotein is one of the key proteins used by HIV-1 to mediate its pathogenicity. The sequence of the env gene is important to encode the Env glycoprotein but also for the secondary structure of the RRE that harbor its transcripts. The relevance of both elements has been extensively proved, although functional assays were needed in both cases to study the impact of specific changes. Treatment with the fusion inhibitor T-20 in patients infected with HIV-1 select resistant viruses to this drug after acquiring changes in their env gene. Therefore, we decided to use T-20-associated changes in order to functionally study relevant in vivo env variants. Predictions of the RRE secondary structures showed alterations when they were encoding for the changes G36V/D, V38A, Q40H and L45M, but not when harboring N43D and Q40H-L45M. Functional data showed that only the mutants harboring the L45M mutation had impairments in their binding capacity to Rev when this protein was at low concentrations, suggesting that the nucleotide changes affecting the encoding of the amino acid 45 in gp41 plays a role in Rev binding. However, none of the RRE variants were affected in their ability to being transported to the cytoplasm. Thus, it was found that alterations in RRE secondary structures predicted from nucleotide sequences might not necessary imply functional impairments and that the L45M change was not incorporated as a secondary mutation due to a restoration of the RRE functions. As it is important to functionally characterize patient-derived Envs to understand their in vivo pathogenesis, we established a complete methodology to study them by focusing on the main role of the subunit gp41. Based on our results, the correct selection of the effector cell line is essential to optimize the sensitivity of the assays. The 293T cell line might be used for fusogenic experiments and the HeLa for analyzing death parameters. Clinical trials had suggested that V38A viral mutants arising in an Env context containing the N140I polymorphism, were low pathogenic due to they were associated with virological failure and immunologic benefits. In order to understand these in vivo discordant data, we used our complete methodology to analyze patient-derived Envs that harbored these changes. We found that the V38A mutant Envs that were arisen in a N140I context were less able to induce single-cell death to target cells despite not having an altered fusogenic capacity. Thus, these data supports the importance of the Env context and the main role of gp41 in HIV-1 pathogenesis.