Caracterización fenotípica del ratón transgénico 116-NOD, y aproximación a la identificación del antígeno reconocido por el anticuerpo monoclonal H116

Abstract

Los modelos animales están sirviendo para el estudio de un gran número de procesos patológicos como es la diabetes autoinmunitaria (T1D). La utilización de ratones transgénicos basados en modelos de enfermedad ya establecidos, como por ejemplo ratones NOD transgénicos, donde se pueden analizar variables muy concretas de la enfermedad, están aportando una gran fuente de conocimiento de los mecanismos inmunopatogénicos que ocurren durante el desarrollo de la T1D. En el presente trabajo hemos estudiado un nuevo modelo experimental, el ratón 116-NOD, portador transgénicamente de genes de inmunoglobulinas que codifican las regiones variables IgH y IgL variable de un hibridoma H116 generado de un linfocito B aislado del infiltrado linfocitario de ratón F1(8.3-NODxNOR), y con una especificidad antigénica restringida por un autoantígeno específico de célula beta-pancreática. Los ratones F1(8.3-NODxNOR) desarrollan insulitis pero son T1D resistentes, y por ello son un buen modelo de resistencia a la enfermedad. El análisis de tres líneas de ratones fundadores 116-NOD, ha mostrado que en los machos se produce una disminución de la incidencia de la enfermedad, y también en las hembras de la línea C (116C-NOD), comparado con ratones NOD. Además coincide que es en esta última línea donde mejor se expresan los transgenes, motivo por el cual decidimos priorizar su estudio en este proyecto. Así, los estudios fenotípicos han mostrado que en ratones 116C-NOD, existe un aumento de los linfocitos B de Zona Marginal junto con un descenso de linfocitos B foliculares y transicionales T1, comparado con ratones NOD. Funcionalmente, los linfocitos B de ratones 116C-NOD transgénicos se encuentran en estado de anergia, aunque es interesante destacar que esta situación no impide que la enfermedad se desarrolle, y de hecho en cierto aspecto parece que incluso puede facilitarla. Además, al igual que los linfocitos B de ratones NOD no transgénicos, tras la estimulación del BCR, los linfocitos B de ratones 116C-NOD secretan principalmente citoquinas de tipo Th1, mientras que tras la estimulación con LPS esta respuesta cambia hacia tipo Th2, aunque con diferencias en cuanto a la producción de IL-10 por parte de los linfocitos B de los ratones 116C-NOD transgénicos, donde es significativamente inferior. Por último, observamos que los linfocitos B de ratones 116C-NOD sufren delección clonal a nivel central, hecho constatado por el bajo número de linfocitos B presente a nivel de bazo en estos ratones, y confirmado posteriormente mediante los estudios de quimeras de médula ósea. Respecto al reconocimiento antígenico del AcMo H116, hemos podido determinar que reconoce un epítopo lineal de la Valosin Containin Protein (VCP) aunque creemos que no es el autoantígeno reconocido in vivo, ya que en condiciones nativas no se produce este reconocimiento, y en cambio el AcMo H116 coprecipita con las proteínas Glucose regulated protein (Grp78), Protein disulfide isomerase associated 6 (PDIA6), Rab GDP dissociation inhibitor beta o Guanosine diphosphate dissociation inhibitor 2 (GDi2, GDi3) y la Clathrin light chain B (Cltb).

Animal models are being used for the study of a large number of pathological processes such as autoimmune diabetes (T1D). The use of transgenic mice based on established disease models such as transgenic NOD mice, which can analyze very specific variables of the disease, are providing a great source of knowledge of the immunopathogenic mechanisms that occur during the development of T1D . In this study we analyzed a new experimental mouse model, the 116-NOD, which bears transgenically genes encoding immunoglobulin variable regions IgH and IgL of the hybridoma H116 generated from an islet-infiltrating B-lymphocyte isolated from a (8.3-NODxNOR)F1 mouse, and which is restricted by an autoantigen from pancreatic beta-cells. (8.3-NODxNOR)F1 mouse develops insulitis but is T1D resistant, and therefore it is a good model of disease resistance. Analysis of three 116-NOD founder mice, showed that there is a reduction in the incidence of disease in males derived from all three founders, and in females of the founder C (116C-NOD) compared to NOD mice. Moreover, the expression of the transgens is also better in 116C-NOD mice, which is why we have decided to prioritize their study in this project. Phenotypic studies have shown that 116C-NOD mice, there is an increase in Marginal Zone B cells along with a decrease in follicular and transitional T1 B cells, compared with NOD mice. Functionally, B cells from transgenic 116C-NOD mice are in a state of anergy, although it is interesting to note that this does not prevent disease development, and indeed in some aspects it seems that even can promote it. Moreover, like B lymphocytes from non transgenic NOD mice after BCR stimulation, B lymphocytes from 116C-NOD mice secrete primarily Th1 cytokines, whereas after stimulation with LPS there is a change towards a Th2 response, with a difference significantly lower in the production of IL-10 by the B lymphocytes from 116C-NOD transgenic mice. Finally, we noticed that B lymphocytes from 116C-NOD mice suffer clonal deletion at the central level, a fact realized by the low level of B cell splenocytes in these mice, and confirmed by studies of bone marrow chimeras. Regarding the antigen recognition by the MoAbH116, we determined that recognizes a linear epitope from the Valosin Containing Protein (VCP), although we believe this is not the autoantigen recognized in vivo, as in native conditions this recognition does not occur; instead, the MoAbH116 coprecipitate with four proteins: the Glucose Regulated protein (Grp78), the Protein disulfide isomerase associated 6 (PDIA6), the Rab GDP dissociation inhibitor beta or Guanosine diphosphate dissociation inhibitor 2 (GDi2, GDi3), and the Clathrin light chain B (Cltb).