Mecanismes de silenciament epigenètic en càncer colorectal

Abstract

Aquest treball parteix de la premissa que els processos de diferenciació cel·lular i tumorigènesi impliquen vies de senyalització i programes relacionats i que l’estudi dels canvis epigenètics subjacents a ambdós processos pot contribuir a un millor coneixement dels mecanismes i factors que determinen el destí i funcions cel·lulars. L’estudi dels patrons epigenètics en aquests processos s’ha realitzat a diferents nivells: escala genòmica, regions regulades conjuntament en càncer (Silenciament Epigenètic de Gran Abast, LRES) i a nivell individual. L’estudi dels patrons de metilació a escala genòmica mitjançant l’AIMS-Seq va permetre determinar que la diferenciació de l’intestí prim es caracteritza per lleus guanys de metilació que s’esdevenen majoritàriament en les regions contigües a illes CpG promotores (CpGi shores) associades a gens implicats en el desenvolupament, regulació de l’expressió i càncer. La gran majoria d’aquests gens no s’expressaven en intestí, estaven hipermetilats en adenomes de ratolins Apcmin/+ i en la línia cel·lular colorectal murina CT26. Els estudis d’expressió gènica amb microarrays revelaren una sobreexpressió en adenomes dels gens involucrats en comunicació cel·lular, angiogènesi i migració, que no es relacionà amb canvis en la metilació del DNA. Així doncs, es pot concloure que els gens implicats en desenvolupament, sovint poc expressats en teixit diferenciat, tendeixen a metilar-se tant en processos de diferenciació com en processos tumorals. Roman per determinar si aquesta tendència a hipermetilar-se durant la diferenciació té una repercussió funcional directa o és conseqüència d’un procés d’estabilització irreversible de la cromatina en un estat de silenciament gènic. Per tal d’analitzar la dinàmica del LRES en diferenciació i càncer van ser claus: el model de diferenciació in vitro de les cèl·lules d’adenocarcinoma humà CaCo2 a cèl·lules amb fenotip d’enteròcit, on s’observà la reversió del LRES; i la determinació que el LRES és un mecanisme conservat en càncer colorectal murí (CT26), fet que va permetre l’ús del ratolí com a model d’estudi. Els adenomes inicials dels ratolins APCmin/+ no mostraren LRES. En fases avançades, el LRES comportà la pèrdua dels subdominis de la regió (disminució de CTCF) i la infraexpressió gènica, essent el silenciament per metilació del DNA i l’adquisició de marques repressives de cromatina (H3K9me/3, EZH2) propis d’estadis més avançats de la carcinogènesi. Tot i que aquests gens tenien dominis bivalents de cromatina (H3K4me3 i H3K27me3) en teixit normal, la hipermetilació en cèl·lules tumorals no comportà una resolució de la bivalència (determinat per reChIP). A més, aquestes regions tendien a estar hiperactivades en cèl·lules progenitores de l’intestí i en adenomes benignes, suggerint la presència d’un possible mecanisme de protecció contra el silenciament regional en cèl·lules no malignes amb elevada capacitat proliferant. Finalment, ens vam interessar pel gen INH-βB, citoquina que dimeritza formant Activines. L'INH-βB està silenciat en càncer colorectal mitjançant LRES i la hipermetilació de la seva CpGi promotora està associada a una reducció de la supervivència del pacient. Els estudis funcionals (proliferació, migració i invasió) en línies cel·lulars colorectals no van demostrar que el silenciament d'aquest gen incrementés la malignitat cel·lular, suggerint que la seva associació amb agressivitat podria està relacionada amb l'extensió del fenomen LRES més que amb un efecte directe del silenciament del gen. Cal emfatitzar la necessitat d’implementar aquests estudis en altres línies cel·lulars i expandir l’anàlisi a altres funcions com són l’adhesió i la resposta a hipòxia per confirmar aquestes interpretacions.

This work is based on the fact that cellular differentiation and tumoral processes concern related pathways and that the study of epigenetic changes involved in both processes could contribute to a better understanding of the mechanisms and factors that determine the cellular fate and function. The analysis of the epigenetic patterns associated with these processes has been performed at different levels: genomic scale, regions regulated concomitantly in cancer (Long Range Epigenetic Silencing, LRES) and specific genes. Genomic methylation patterns throughout small intestine differentiation were analyzed by AIMS-Seq showing slight gains of methylation, mainly in regions contiguous to promoter CpG island (CpGi shores) of genes involved in development and cancer. The great majority of these genes were not expressed in intestine and were hypermethylated in Apcmin/+ mouse adenomas and in colorectal cell line CT26. Microarray analysis revealed that adenomas overexpressed genes implicated in cellular communication, angiogenesis and wound healing, although they did not present variations in DNA methylation. Therefore, genes involved in development, usually expressed at low levels in differentiated tissue, tend to be methylated during cellular differentiation and tumoral progression. It remains to be elucidated whether this tendency to hypermethylation during differentiation has a direct functional effect or it just implies a irreversible chromatin stabilization after genetic silencing. In order to analyze LRES dynamics during differentiation and cancer processes we worked with in vitro differentiation of the adenocarcinoma cell line CaCo2 to enterocyte-like population, in which LRES was reverted. Furthermore we determined the occurrence of the LRES mechanism in murine colorectal carcinoma (CT26), which let us to compare the mouse and human LRES processes. Initial adenomas from APCmin/+ mice did not show LRES. In advanced stages, LRES implied the loss of regional boundaries (CTCF) and transcriptional down-expression, being the silencing by DNA methylation and the acquisition of chromatin repressive marks (H3K9me2/3, EZH2) features of later stages of carcinogenesis. Although these genes presented chromatin bivalent domains (H3K4me3 and H3K27me3) in normal tissue, DNA hypermethylation in tumoral cells did not imply resolution of bivalent states (determined by reChIP). Moreover, these regions tend to be more transcriptionally active in intestinal progenitor cells and benign adenomas, suggesting that this elevated expression could be a possible protective mechanism against regional silencing in non-malignant cells with high proliferative capacity. Lastly, we were interested in INH-βB, a cytokine that dimerizes forming Activins. INH-βB is silenced in colorectal cancer by LRES and the hypermethylation of its promoter CpG island has been associated with a reduction of patient survival. Functional studies (proliferation, migration and invasion) in colorectal cell lines did not demonstrate that INH-βB silencing increases malign cell properties. Therefore, the association with aggressiveness could be due to the LRES extension instead of the direct effect of INH-βB silencing. In order to confirm this interpretation it is necessary to extend these functional studies to other cell lines and to investigate other functions, such as adhesion and response to hypoxia.