Regulation of neuroinflammation by cGMP-mediated pathways.

Abstract

En el trabajo aquí presentado se investigó la participación de los niveles intracelulares de GMP-cíclico (CMPC) en la regulación de diferentes aspectos de la neuroinflamación. En el primer capítulo hemos observado que los cultivos de astrocitos y de celulas microgliales aisladas de rata expresan la maquinaria necesaria para sintetizar GMPc en repuesta a Péptidos Natriuréticos (PN) y también los enzimas necesarios para degradar el nucleótido. También se investigaron los efectos de la estimulación por PN en la expresión de la proteína pro-inflamatoria iNOS. Hemos observado que el pretratamiento con ANP hace disminuir los niveles de la proteína iNOS inducida por el agente pro-inflamatorio LPS a través de un mecanismo dependiente de NPR-A-PKG en células microgliales cultivadas de rata. Además hemos observado que esta regulación a la baja parece estar hecha a nivel de traducción, sin afectar a la transcripción o la tasa de degradación de la proteína. Sobre la base de datos obtenidos en nuestro laboratorio en cultivos de células gliales, se ha demostrado que las vías mediadas por GMPc regulan la dinámica del citoesqueleto, la expresión de GFAP en los astrocitos y la motilidad, así como la expresión de genes inflamatorios en la microglía que se demuestra en el primer capítulo, lo que sugiere un papel en la regulación del fenotipo reactivo glial. En el segundo capítulo, hemos querido verificar si el GMPc regula la respuesta inflamatoria glial in vivo después de un daño producido en el SNC causado por una criolesión focal en la corteza cerebral en ratas y ratones. Se investigó el efecto de 3 dosis de tratamiento con dos inhibidores de diferentes fosfodiesterasas de GMPc (PDE), zaprinast y sildenafilo. Hemos observado que el inhibidor no selectivo de PDE-GMPc zaprinast potencia la astrogliosis alrededor de la lesión, mientras que produce una disminución de la activación de macrófagos/microglía, el estrés oxidativo y muerte neuronal en la rata. Se observó también que el tratamiento con el inhibidor selectivo de la PDE5 sildenafilo reproduce en los ratones los cambios en la reactividad glial y los efectos antioxidantes y antiapoptóticos observados anteriormente con el zaprinast en ratas, indicando que la inhibición de la PDE5 es responsable de estas acciones neuroprotectoras. Sin embargo, los efectos de sildenafilo no se observaron en los ratones deficientes en MT-I/II. Asimismo, se muestra que el sildenafilo aumenta significativamente los niveles de las proteínas MT-I/II en homogenados corticales de ratones lesionados así como la inmunotinción de MT-I/II en las células gliales alrededor de la lesión, y disminuye la activación del factor transcriptor de STAT3, apoyando la participación de estas proteínas en los efectos neuroprotectores del sildenafilo en la lesión cerebral focal. Como resultado de los efectos antiinflamatorios y neuroprotectores observados por los inhibidores de la PDE5 en el modelo criolesión, en el tercer capítulo se investigó si el tratamiento con sildenafilo podría tener efectos beneficiosos en un modelo de EAE inducido por MOG35-55, un modelo animal de esclerosis múltiple, una enfermedad en la que existe una respuesta inflamatoria alterada. Se demuestra que el tratamiento con sildenafilo después del inicio de la enfermedad reduce notablemente los síntomas clínicos de la EAE mediante la prevención de la pérdida axonal y la promoción de la remielinización. Por otra parte, el sildenafilo disminuye la infiltración de leucocitos CD3+ así como la activación de microglia/macrófagos en la médula espinal, al tiempo que aumenta la presencia de Foxp3-Tregs. Además, el tratamiento con sildenafilo disminuye la expresión de ICAM-1 en las células infiltradas de la médula espinal. La presencia de astrocitos reactivos que forman estructuras similares a cicatrices alrededor de los infiltrados se potenció por el tratamiento con sildenafilo, sugiriendo un posible mecanismo para restringir la propagación de leucocitos en el parénquima sano. Se demuestra también que el tratamiento con sildenafilo al inicio de los síntomas clínicos, cuando el proceso inflamatorio es más fuerte, impide el avance de la enfermedad y regula la respuesta adaptativa inmune periférica y los niveles de la PDE5. Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos se demuestra que la modulación de los niveles intracelulares de GMPc tiene efectos beneficiosos en los procesos neuroinflamatorios y que estos beneficios están relacionados con la regulación de la gliosis reactiva, el estrés oxidativo, factores antioxidantes, la respuesta inmune adaptativa y la infiltración de células inmunes en el SNC que conducen a una disminuición en el daño neuronal.

In the present work we investigated the involvement of intracellular cGMP levels in regulating different aspects of neuroinflammation. In the first chapter we observed that cultured rat astrocytes and microglial cells express the necessary machinery to synthesize cGMP in response NPs and to degrade the nucleotide. We also investigated the effects of NP stimulation in the expression of the pro-inflammatory protein iNOS. We observed that pretreatment with ANP down-regulates iNOS protein levels induced by the pro-inflammatory agent LPS by an NPR-A-PKG dependent mechanism in rat cultured microglial cells. In addition we found that this down-regulation seems to be done at translational level, without affecting transcription or protein degradation rate. Based on evidence obtained in our laboratory in cultured glial cells indicates that cGMP-mediated pathways regulate cytoskeleton dynamics, GFAP expression and motility in astrocytes, as well as inflammatory gene expression in microglia found in the first chapter, suggesting a role in the regulation of the glial reactive phenotype. In the second chapter we wanted to examine if cGMP regulates the glial inflammatory response in vivo following CNS damage caused by a focal cryolesion onto the cortex in rats and mice. We investigated the effect of 3 doses of treatment with two different cGMP-phosphodiesterase (PDE) inhibitors, zaprinast and sildenafil. We observed that the non-selective GMP-PDE inhibitor zaprinast enhances astrogliosis around the lesion while decreasing macrophage/microglial activation, oxidative stress and neuronal death in rat. We observed also that treatment with the selective PDE5 inhibitor sildenafil reproduces in mice the changes in glial reactivity and the antioxidant and antiapoptotic effects previously observed with zaprinast in rats indicating that inhibition of PDE5 is responsible for these neuroprotective actions. However, sildenafil effects were not observed in mice deficient in MT-I/II. We further show that sildenafil significantly increases MT-I/II protein levels in lesioned cortical homogenates and MT-I/II immunostaining in glial cells around the lesion, and decreases activation of the transcriptor factor STAT3, supporting the involvement of these proteins in the neuroprotective effects of sildenafil in focal brain lesion. As a result of the anti- inflammatory and neuroprotective effects observed by PDE5 inhibitors in the cryolesion model, in the third chapter we investigate if treatment with sildenafil could have beneficial effects in a MOG35-55-induced EAE model, an animal model of MS, a disease where an altered inflammatory response occurs. We show that treatment with sildenafil after disease onset markedly reduces the clinical signs of EAE by preventing axonal loss and promoting remyelination. Furthermore, sildenafil decreases CD3+-leukocyte infiltration and microglial/macrophage activation in the spinal cord, while increasing Foxp3-Tregs. In addition, sildenafil treatment decreased ICAM-1 in spinal cord infiltrated cells. The presence of reactive astrocytes forming scar-like structures around infiltrates was enhanced by sildenafil suggesting a possible mechanism for restriction of leukocyte spread into healthy parenchyma. We show also that treatment with sildenafil at the onset of clinical symptoms, when the inflammatory process is stronger, prevent disease advance and regulates peripheral adaptative immune response and PDE5 levels. Taking in account all the results obtained we evidenced that modulation of intracellular cGMP levels have beneficial effects in neuroinflammatory processes and that this benefits are related to regulation of reactive gliosis, oxidative stress, antioxidant factors, adaptative immune response and infiltration of immune cells into CNS leading to decrease neuronal damage.