Regulación y función de las brain-specific kinases 1 y 2 (BRSk1 y BRSk2, también llamadas SAD quinasas) en la diferenciación y sinapsis neuronales.

Abstract

Las proteínas quinasas BRSK1 y BRSK2 (Brain-specific kinase 1 y 2) pertenecen a la familia de las AMPK-related kinases, y son activadas mediante fosforilación por la proteína kinasa supresora de tumores LKB1. Las BRSKs se expresan mayoritariamente en cerebro, donde juegan un papel clave en el establecimiento de la polaridad neuronal y sinaptogénesis. En la neurona madura, BRSK1 modularía la función sináptica controlando la liberación de neurotransmisores en la neurona madura. Así pues, LKB1-BRSK1/2 constituye una nueva vía de señalización crucial para la función neuronal. Sin embargo, se desconoce cómo las BRSKs ejercen su función, dado que no se han descrito los mecanismos que regulan su actividad (LKB1 es una quinasa constitutivamente activa) ni los sustratos a través de los cuales median su función. En este trabajo se han obtenido y puesto a punto las herramientas bioquímicas para el estudio de las BRSKs (anticuerpos, constructos de DNA, preparaciones puras y activas, etc.), que se han utilizado para mostrar que tanto el desarrollo ontogénico del cerebro como la diferenciación neuronal transcurren con un aumento de expresión de BRSK1 y BRSK2. Mediante ensayos de gene-reporter luciferase e inmunoblots demostramos que las neurotrofinas NGF y BNDF promueven el aumento de la transcripción y expresión de las BRSKs, en un proceso mediado por la vía de señalización de Ras-Raf-MEK1-ERK1/2 y el factor de transcripción Sp1. Por otra parte, se ha caracterizado el patrón de localización subcelular de las BRSKs en neuronas corticales maduras: BRSK1 presenta un marcaje puntuado (similar al que del marcador de vesículas sinápticas sinaptofisina), y BRSK2 presenta una distribución homogénea a lo largo del soma, axón y dendritas, donde co-localiza con el marcador MAP2. Por primera vez se describe que las BRSKs se expresan en células gliales. Por primera vez se muestra en sinaptosomas de cerebro de rata la existencia de un pool de BRSK1, pero de BRSK2 o LKB1, en microdominios de membrana ricos en colesterol lipid rafts, y que esta localización resulta en una BRSK1 que presenta una mayor actividad kinasa que la proteína citosólica. Mediante ensayos de purificación de los lípidos de lipid rafts y reconstitución de vesículas multilamelares lipídicas, así como utilizando lípidos sintéticos, se muestra que la actividad kinasa BRSK1 (pero BRSK2) es regulada por el entorno lipídico mediante un mecanismo nuevo, diferente al de fosforilación por LKB1. Por último, se ha identificado un nuevo sustrato para BRSK1: la proteína t-SNARE sintaxina-1A, que regula la liberación de neurotransmisores a nivel presináptico. Mediante ensayos de fosforilación, generación de mutantes de deleción y análisis por espectrometría de masas se ha identificado un residuo de Serina como el residuo de sintaxina-1A fosforilado por BRSK1. Esta fosforilación presenta una estequiometría de 1 mol de fosfato incorporado por mol de sintaxina, y ha sido confirmada mediante ensayos radiométricos de fosforilación utilizando diferentes formas mutantes de las proteínas BRSK1 y sintaxina. Se ha generado y caracterizado un anticuerpo que reconoce específicamente el residuo de Ser fosforilado, lo que ha permitido demostrar que BRSK1 fosforila a esta Ser en sistemas celulares.

Brain-specific kinase 1 and 2 (BRSK1 and BRSK2) belong to the AMPK-related family protein kinases, and they are activated by direct phosphorylation by the LKB1 tumor suppressor protein. BRSK proteins are expressed within the brain, where they play a crucial role for establishing neuronal polarity and synaptogenesis. BRSK1 also modulate synaptic function and neurotransmitter release in the mature neuron. Therefore, LKB1-BRSKs is a new signaling pathway that plays a pivotal role in neuronal function. However, how BRSKs exert their functions is unknown, since their substrates and the mechanisms modulating their activity remain to be described. In this study we have obtained new molecular and biochemical tools for the study of the BRSKs (antibodies, DNA constructs, etc), that allow us to show that neuronal differentiation and brain maturation processes take place with an increase of expression of BRSK1 and BRSK2 proteins. Using gene-reporter and immunoblot assays, we show that NGF and BDNF neurotrophins induce an increase on BRSKs transcription and translation, by a process which involves Ras-Raf-MEK1-ERK1/2 signaling pathway and the Sp1 transcription factor. We also study BRSKs subcellular localization from rat cultured cortical neurons by immunocytochemical assays. BRSK1 shows a punctuate pattern, similar to that observed for the synaptic vesicle protein marker synaptophysin, whereas BRSK2 mainly localize throughout the neuron in both axon and dendrites co-localizes with dendritic marker MAP2. We also report by the first time that glial cells express both, BRSK1 and BRSK2 proteins. We provide biochemical and pharmacological evidences demonstrating that a pool of BRSK1, but not BRSK2 or LKB1, localizes at membrane lipid rafts. We also show that raft-associated BRSK1 has higher activity than BRSK1 from non-raft environment. Further, recombinant BRSK1 activity increased 3-fold when assayed with small multilamellar vesicles (SMV) generated with both, lipids extracted from synaptosomal raft fractions or synthetic SMV made with authentic phosphatidylcholine, cholesterol and sphingomyelin. Interaction with lipid rafts represents a new mechanism of BRSK1 activity modulation, additional to T-loop phosphorylation. Finally, we have identified a new BRSK1 substrate, namely syntaxin-1A. Using phosphorylation and mass-spec analysis we have mapped and identified a residue of Ser that is mainly phosphorylated by BRSK1, showing a stechiometry of 1 mol P per mol of protein. We have generated an antibody that specifically recognizes this Ser residue and provided evidences showing that this phosphorylation occurs in vivo.