Caracterización de la disfunción vascular sanguínea y linfática en la cirrosis hepática: Evaluación de la inhibición del factor de crecimiento placentarioy del óxido nítrico como estrategias terapéuticas

Abstract

El hígado cirrótico experimenta a lo largo de todo el desarrollo de la enfermedad una serie de cambios estructurales, debidos a la acumulación de matriz extracelular y a la inflamación crónica, que vuelven al tejido hipóxico. La hipoxia tisular provoca la liberación de agentes proangiogénicos, como VEGF-A, que aumentan la irrigación del tejido para compensar la falta de oxígeno. Además, muchas citoquinas sintetizadas por las células inflamatorias o por las células hepáticas estrelladas activadas, también tienen un alto poder angiogénico. Estos nuevos vasos son una puerta de entrada de más infiltrado inflamatorio, estableciéndose así un circuito que se retroalimenta entre angiogénesis e inflamación que lleva a perpetuar la enfermedad. En este contexto, las terapias antiangiogénicas clásicas dirigidas a bloquear VEGF o las vías de los receptores tirosina quinasa, han demostrado ser eficaces en disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepática, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias se han visto relacionadas con multitud de efectos adversos, como trombosis o hipertensión, ya que no sólo inhiben la angiogénesis patológica sino que también afectan a la vasculatura sana (Fischer et al., 2007; Wu et al., 2008). De manera que la necesidad de encontrar nuevas dianas terapéuticas más seguras destinadas a modular la angiogénesis en la cirrosis hepática sigue siendo uno de los objetivos de la investigación científica actual. Cuando la cirrosis pasa a ser descompensada, los pacientes cirróticos desarrollan importantes alteraciones en la homeostasis de los líquidos corporales que dan lugar a la acumulación de ascitis. La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos y constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se han descrito la implicación de diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua o la reactividad vascular (Arroyo and Jiménez, 2000). La probabilidad de fallecimiento a los 2 años en pacientes cirróticos, una vez que desarrollan ascitis, es del 40%. A pesar de la enorme relevancia clínica de este suceso, actualmente aun no se conocen con precisión todos los mecanismos moleculares implicados en la formación y mantenimiento de la ascitis en la cirrosis. El objetivo global de esta tesis doctoral fue el de investigar la implicación de la vasculatura, tanto sanguínea como linfática, en la patogenicidad de la cirrosis hepática. De manera específica, la tesis está dividida en dos estudios dirigidos a: I. Investigar el papel fisiopatológico del factor de crecimiento placentario (PlGF) en la angiogénesis, la inflamación y la fibrosis hepática. II. Caracterizar la funcionalidad y la estructura de la vasculatura linfática en la cirrosis e investigar su contribución a la formación de ascitis.

Estudio I: Durante la progresión de gran cantidad de enfermedades hepáticas crónicas tiene lugar un proceso de neoangiogénesis hepática que agrava profundamente dichas patologías. Además, se ha demostrado que diversos factores angiogénicos también son capaces de activar diferentes subpoblaciones de células hepáticas estrelladas, estableciendo así un vínculo entre inflamación, angiogénesis y fibrosis hepáticas (Thabut et al., 2010; Semela et al., 2008). En este contexto, se ha demostrado que la administración de sunitinib y sorafenib a ratas cirróticas, dos inhibidores multidiana de receptores tirosina quinasa que actúan en las vías de señalización de PDGF y VEGF, conseguía disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepáticas, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias dirigidas a inhibir VEGF están asociadas a graves efectos adversos, como trombosis, hipertensión o una disminución de la densidad vascular en órganos sanos (Fischer et al., 2007), ya que VEGF también tiene importantes funciones en la angiogénesis fisiológica. Estudios recientes sugieren que las terapias enfocadas a inhibir el PlGF podrían tener un perfil de bioseguridad mucho más óptimo que las terapias antiangiogénicas clásicas (Fischer et al., 2007; Van de Veire et al., 2010). Esto es así porque la acción angiogénica de PlGF se reduce únicamente a situaciones patológicas (Autiero et al., 2003; Van Steenkiste et al., 2009).

Resultados I: La cirrosis está asociada a una sobreexpresión de PlGF, tanto en humanos como en modelos experimentales. Cuando se bloquea la actividad de PlGF en cirrosis se consigue disminuir la angiogénesis hepática y en esplácnica, el infiltrado inflamatorio hepático, la fibrosis y la hipertensión portal; todo ello sin efectos adversos.

Estudio II: Una de las complicaciones más severas durante la progresión de la cirrosis es la formación de ascitis, que está asociada con un incremento de la morbilidad y la mortalidad (Moore et al., 2003). Algunos de los mecanismos que contribuyen a la aparición y al mantenimiento de la ascitis son: 1) el incremento de la presión hidrostática intravascular, 2) el descenso de la presión oncótica en el plasma, 3) un aumento de la angiogénesis en el territorio esplácnico y 4) la retención renal de sal y agua (Gines et al., 2004; Van Steenkiste et al., 2009; Henriksen et al., 2005). Sin embargo, la función del sistema linfático en la patogénesis de la ascitis no está bien estudiada. En los pacientes cirróticos compensados, el sistema linfático ayuda a prevenir la aparición de ascitis reabsorbiendo el exceso de fluido, tanto en el hígado, como en las demás regiones de la zona esplácnica. Como consecuencia de esto aumenta el flujo linfático (Witte et al., 1969), lo que estimula la aparición de linfangiogénesis hepática (Tugues et al., 2005). A pesar de ello, este mecanismo compensatorio no es capaz de evitar la formación de ascitis en pacientes con cirrosis descompensada y esto hace hipotetizar que existe una disfunción del sistema linfático en los estadíos más avanzados de la enfermedad.

Resultados II: En cirrosis, las células endoteliales linfáticas sobreexpresan eNOS y tienen una sobreproducción de NO que lleva a una pérdida de recubrimiento de los vasos linfáticos por células musculares lisas y a una disfunción del sistema linfático. Cuando se bloquea la actividad de eNOS se consigue recuperar el recubrimiento de vasos linfáticos por células musculares lisas, aumenta el drenaje del sistema linfático y disminuye el volumen de ascitis.

Study I: Placental growth factor (PlGF) is associated selectively with pathological angiogenesis, and PlGF blockade does not affect the healthy vasculature. Anti-PlGF is therefore currently being clinically evaluated for the treatment of cancer patients. In cirrhosis, hepatic fibrogenesis is accompanied by extensive angiogenesis. In this study, we evaluated the pathophysiological role of PlGF and the therapeutic potential of anti-PlGF in liver cirrhosis.

Results I: PlGF was significantly up-regulated in the CCl4-induced rodent model of liver cirrhosis as well as in cirrhotic patients. Compared with wild-type animals, cirrhotic PlGF -/- mice showed a significant reduction in angiogenesis, arteriogenesis, inflammation, fibrosis, and portal hypertension. Importantly, pharmacological inhibition with anti-PlGF antibodies yielded similar results as genetic loss of PlGF. Notably, PlGF treatment of activated hepatic stellate cells induced sustained extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation, as well as chemotaxis and proliferation, indicating a previously unrecognized profibrogenic role of PlGF. In conclusion, PlGF is a disease-candidate gene in liver cirrhosis, and inhibition of PlGF offers a therapeutic alternative with an attractive safety profile.

Study II: The lymphatic network plays a major role in maintaining tissue fluid homoeostasis. Therefore several pathological conditions associated with oedema formation result in deficient lymphatic function. However, the role of the lymphatic system in the pathogenesis of ascites and oedema formation in cirrhosis has not been fully clarified. The aim of this study was to investigate whether the inability of the lymphatic system to drain tissue exudate contributes to the oedema observed in cirrhosis.

Results II: The cirrhotic (CH) rats had impaired lymphatic drainage in the splanchnic and peripheral regions compared with the control (CT) rats. LyECs isolated from the CH rats showed a significant increase in eNOS and nitric oxide (NO) production. In addition, the lymphatic vessels of the CH rats showed a significant reduction in smooth muscle cell (SMC) coverage compared with the CT rats. CH rats treated with L-NMMA for 7 days showed a significant improvement in lymphatic drainage and a significant reduction in ascites volume, which were associated with increased plasma volume. This beneficial effect of L-NMMA inhibition was also associated with a significant increase in lymphatic SMC coverage. In conclusion, the upregulation of eNOS in the LyECs of CH rats causes long-term lymphatic remodelling, which is characterised by a loss of SMC lymphatic coverage. The amelioration of this lymphatic abnormality by chronic eNOS inhibition results in improved lymphatic drainage and reduced ascites.