Torulaspora delbrueckii: aplicaciones tecnológicas y aislamiento de genes de respuesta a estrés.

Abstract

Durante los últimos años la producción de masas congeladas para bollería ha experimentado un notable incremento. La calidad de estos productos está lejos de la que se obtiene a partir de masas frescas Esto es debido a la sensibilidad al proceso de congelación y descongelación de S. cerevisiae y a la reducción de su capacidad fermentativa durante el almacenamiento. Si las masas congeladas son azucaradas el problema es todavía mayor. En la elaboración de masas dulces se utiliza hasta un 30% de azúcar provoca una fuerte reducción de la actividad de agua generando ambientes de alta presiones osmóticas. Como consecuencia de todo esto el tiempo de fermentación de estas masas se prolonga y el volumen del producto se reduce. Para resolver este problema es habitual que los industriales añadan cantidades adicionales de levadura de entre un 8-12% lo cual incrementa el coste del producto final y modifica sus características organolépticas. Todo esto ha generado la demanda de nuevas cepas de levadura de panadería con características de osmotolerancia y crioresistencia. Sin embargo pese a los numerosos esfuerzos realizados para la construcción, mediante técnicas de genética clásica o de ADN-recombinante, de cepas industriales más osmotolerantes y crioresistentes, no se dispone en la actualidad de ninguna cepa comercial que cumpla estos requisitos. Frente a esta alternativa, en este trabajo nos planteamos el estudio y la utilización en el proceso de panificación de levaduras silvestres de panaderia con características intrínsecas de crioresistencia y osmotolerancia Concretamente, hemos centrado nuestro interés en el estudio de T. delbrueckii. Dos cepas de esta especie, las cepas PYCC5321 e IPYCC5323, muestran una elevada viabilidad y capacidad fermentativa en masas congeladas. Esta característica junto con el hecho de que son levaduras que se encuentran frecuentemente en alimentos y bebidas con altas concentraciones de azúcares nos lleva a pensar en la posibilidad de utilizar esta especie como modelo de estudio de tolerancia a estrés en levadura de panadería. <br/>Esta tesis esta estructurada en forma de publicaciones. En la primera de ellas se estudia la potencial utilización industrial de las cepas de T. delbrueckii PYCC5321 y PYCC5323 para la producción de masas dulces congeladas, analizando además parámetros fisiológicos relacionados con osmotolerancia y crioresistencia como son la síntesis y acumulación de glicerol y trehalosa. El segundo Capítulo de este trabajo comprende dos publicaciones centradas en la obtención de herramientas moleculares para poder utilizar a T. delbrueckki como modelo de levadura de panadería de tolerancia a estrés. En la primera de ellas se describe como la obtención de una genoteca de la cepa PYCC5321 nos ha permitido clonar y caracterizar el gen TdURA3 de T. delbrueckki. En la segunda publicación se muestra la obtención de cepas auxótrofas para uracilo en esta levadura con las cuales hemos analizado la potencialidad T. delbrueckii para expresar y secretar proteínas heterólogas. En el tercer Capítulo se estudian en T. delbrueckii las dos rutas mas importantes implicadas en la respuesta a estrés osmótico y salino en levadura, la ruta HOG y la ruta de la calcineurina-Crz1p. Para este fin, hemos aislado el gen TdHOG1 , que codifica un proteína altamente homóloga a la MAP quinasa Hog1p , así como los genes TdENA1 y TdCRZ1 los cuales codifican respectivamente para una proteína homologa a la ATPasa ENA1, implicada en la detoxificación celular de sodio y litio, y para un factor trancripcional con una cierta homología al factor Crz1p de S. cerevisiae.

This work is organized as a compound of five publications. On the first one we confirm that T. delbrueckii strains PYCC5321 and PYCC5323, fulfil the most important requisites of modern baking in sweet and frozen sweet doughs. We also observed that the strain PYCC5321 shows a clear phenotype of osmotolerance and Na+ toxicity resistance in synthetic media. Therefore these strain could be a good model to identify co-ordinately expressed genes under those conditions in bakers yeast. On the second part of this work we used a genomic library of the PYCC5321 strain in order to isolated the TdURA3 gene, encoding a orotidine-5'-phosphate decarboxilase, and we used the sequence of these gene to construct a T. delbrueckii Ura- host strain for genetic manipulation, the FRY112 strain. Due to the potential biotechnological application of Torulaspora, we used these strain to confirm its use as a host of heterologous genes. In the last part of this work, we studied in T. delbrueckii two of the most important pathways implied in osmotolerance and ionic resistance in S. cerevisiae, the HOG pathway and the Calcineurin-Crz1p pathway. For this purpose, we have cloned the TdHOG1 gene, encoding a putative 427-amino acids protein which displayed a high degree of identity with the MAPK Hog1p of S. cerevisiae. We also cloned the TdENA1 and TdCRZ1 genes , which a putative Na+/Li+ P-Type ATPase and a zinc finger protein homologous to S. cerevisiae Crz1p. We concluded that in T. delbrueckii exists a HOG and Calcineurin-Crz1p pathways with different functional roles of S. cerevisiae.