Modelos proteicos para el estudio de la agregación amiloide in vitro e in vivo

Abstract

Durante los últimos años la agregación proteica se ha convertido en un tema de elevada importancia en biología, biotecnología y medicina. Un número creciente de evidencias demuestran fehacientemente que el mal plegamiento de proteínas y su agregación, muchas veces en forma de fibras amiloides, conlleva la formación de depósitos celulares insolubles que son los responsables finales de un creciente número de enfermedades humanas. Este tipo de enfermedades, agrupadas bajo el concepto de enfermedades conformacionales, engloban una gran diversidad de afecciones tanto neurodegenerativas como sistémicas de las que cabria destacar enfermedades con una gran relevancia socioeconómica como pueden ser la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington o la diabetes tipo II entre otras. La producción recombinante en células bacterianas de las proteínas implicadas en este tipo de enfermedades da lugar, muchas veces, a la formación de agregados proteicos, denominados cuerpos de inclusión (IBs), que obstaculizan la obtención de éstas en su forma nativa. Aunque inicialmente se creyó que estos IBs eran simplemente agregados de proteínas plegadas de forma amorfa a causa de interacciones básicamente hidrofóbicas, recientes estudios han demostrado que éstos están compuestos mayoritariamente por proteínas recombinantes producidas que agregan adquiriendo conformaciones amiloides similares a las obtenidas en humanos. Este hecho hace que el estudio de estos IBs bacterianos pueda ser de vital importancia para la comprensión de las enfermedades conformacionales en humanos. Esta tesis está centrada en el estudio de los procesos de agregación proteica y en la caracterización de los agregados formados tanto in vitro como in vivo utilizando como modelo varias proteínas y péptidos sin ningún tipo de homología secuencial ni estructural en un intento de abarcar un amplio abanico conformacional que ilustre el universo conformacional de las proteínas. Son muchos los factores, tanto intrínsecos como extrínsecos a la cadena polipeptídica, que pueden influir en el proceso de formación de fibras amiloides in vitro. El estudio de la influencia de estos determinantes nos permite conocer las interacciones que dirigen la deposición proteica y proponer posibles mecanismos de agregación. Los resultados obtenidos nos han permitido estudiar en detalle el efecto que tienen algunos de estos factores esenciales sobre la agregación proteica, y como su efecto puede variar dependiendo de las características conformacionales de las proteínas. El estudio del efecto de estos determinantes nos ha permitido obtener información sobre las interacciones moleculares que dirigen la formación de las fibras amiloides y de los posibles mecanismos que pueden seguir las proteínas, inicialmente solubles, para adquirir la estructura común en hoja β altamente ordenada. Puesto que las células procariotas se han convertido en sistemas sencillos pero fisiológicamente relevantes para el estudio de la formación de estos agregados, la segunda parte de esta tesis se ha centrado en el estudio biofísico in vivo de los agregados formados en el interior celular utilizando células procariotas como modelo. Los resultados obtenidos demuestran que las proteínas presentes en IBs bacterianos muestran estructuras amiloides comparables a las obtenidas tanto in vitro como en organismos eucariotas, y que los factores estudiados in vitro también pueden afectar, de forma similar, a la formación amiloide in vivo.

In recent years, protein aggregation has become a topic of great importance in biology, biotechnology and medicine areas. A growing body of evidences show conclusively that the protein misfolding and aggregation, often in the form of amyloid fibrils, leading to the formation of insoluble cellular deposits that are ultimately responsible for an increasing number of human diseases. Such diseases, grouped under the concept of conformational diseases, encompass a wide variety of neurodegenerative and systemic disorders which can be highlighted with a large socioeconomic importance such as Alzheimer's disease, Parkinson's diseases, Huntington's diseases and type II diabetes among others. The recombinant production of proteins involved in these diseases in bacterial cells leads often to the formation of protein aggregates, called inclusion bodies (IBs), hindering the obtaining of these in their native form. Although it was initially believed that these IBs were simply folded protein aggregates amorphous basically because of hydrophobic interactions, recent studies have shown that these IBs are mainly composed of recombinant proteins acquiring amyloid conformations similar to those in humans. This fact makes the study of these bacterial IBs can be of vital importance for the understanding of conformational diseases in humans. This thesis is based on the study of protein aggregation processes and in the characterization of the aggregates formed in vitro and in vivo using as model various proteins and peptides without any structural or sequence homology. Many factors, both intrinsic and extrinsic to the polypeptide chain, can influence the process of amyloid fibril formation in vitro. The study of the influence of these determinants allows us to understand the interactions that direct protein deposition and suggest possible mechanisms of aggregation. The results obtained have allowed us to study in detail the effect of some of these factors in protein aggregation, and their effect may vary depending on the conformational characteristics of proteins. The study of the effect of these determinants has allowed us to obtain information about the molecular interactions that direct the formation of amyloid fibers and possible mechanisms that may follow the protein, soluble initially to acquire the common structure in highly ordered β sheet. Since prokaryotic cells have become simple but physiologically relevant systems for the study of the formation of these aggregates, the second part of this thesis has focused on biophysical study in vivo of the aggregates formed within the cell using prokaryotic as a model. The results demonstrate that the proteins in bacterial IBs show amyloid-like structures comparable to those obtained in vitro and in eukaryotes, and in vitro study factors can also affect similarly to amyloid formation in vivo.