Plaques de cromatina dels cromosomes metafàsics: estructura i autoassociació

Abstract

El plegament de la cromatina a l’interior dels cromosomes metafàsics segueix sent un dels problemes més difícils de resoldre de la biologia estructural. La majoria dels models de plegament més acceptats, que presenten la fibra de cromatina com a unitat bàsica, van ser proposats en condicions de molt baixa força iònica. Mitjançant múltiples tècniques microscòpiques, es va observar que els cromosomes metafàsics contenen un nou element bàsic de plegament: la placa de cromatina. Com a objectiu general, el treball experimental realitzat en aquesta tesi pretén ampliar el coneixement sobre l’estructura interna dels cromosomes metafàsics utilitzant condicions iòniques properes a les observades a la metafase. En primer lloc, s’ha estudiat l’estructura dels cromosomes dins les cèl·lules mitjançant microscòpia de polarització. Per altra banda, s’ha realitzat un ampli estudi de la capacitat d’autoassociació de fragments de cromatina de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes en condicions properes a la metafase. Mitjançant microscòpia de polarització, s’ha vist que els cromosomes metafàsics en medi aquós dins els sacs cel·lulars, són estructures òpticament isotròpiques. L’isotropia observada permet concloure que els cromosomes metafàsics no estan formats per piles paral·leles de nucleosomes. Aquesta possibilitat no exclou però l’associació de les cares laterals dels nucleosomes, que podrien donar lloc a piles amb diferents orientacions. Els resultats obtinguts mitjançant microscòpia electrònica de transmissió de fragments de cromatina obtinguts per digestió amb nucleasa micrococal de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes, mostren que únicament adopten una conformació estesa quan la concentració iònica del medi és molt baixa (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). En condicions iòniques properes a la metafase (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), els fragments de cromatina obtinguts tenen la capacitat intrínseca de formar estructures laminars per autoassociació. A més, no s’observen fibres de cromatina. Les plaques formades per autoassociació presenten les mateixes característiques que les emanades directament de cromosomes metafàsics: són estructures compactes, de superfície llisa i multilaminars. L’alçada de les plaques formades per autoassociació de fragments de cromatina metafàsica determinada a partir de mostres platinades unidireccionalment és de 6.8 ± 1.0 nm per làmina. Aquest valor coincideix amb l’alçada de les plaques emanades de cromosomes parcialment desnaturalitzants, observades al grup. L’aparició d’estructures laminars de gruix superior en mostres sotmeses a incubacions llargues a 25 i 37ºC, indica l’elevada tendència de les làmines de cromatina d’apilar-se i formar estructures multilaminars. Els cossos circulars compactes de 30 nm observats als voltants de les plaques obtingudes, sumat a la presència d’altres estructures circulars més petites sobre les plaques, suggereix que els cossos de 30 nm són estructures intermediàries durant el procés de formació de plaques. Tenint en compte que l’alçada d’un nucleosoma és de 11 nm i que no hi ha evidències que suggereixin una col·locació en columnes dels nucleosomes a les plaques, els resultats indiquen que els nucleosomes es distribueixen de forma parcialment inclinada a l’interior de les plaques. A partir dels resultats obtinguts, es pot suggerir que els nucleosomes a les plaques estan orientats irregularment. La interdigitació entre les làmines successives permet la interacció entre les cares laterals dels nucleosomes i dóna estabilitat a les plaques. La tendència a l’autoassociació de fragments de cromatina metafàsica per formar estructures multilaminars molt estables, suggereix que les cromàtides contenen cromatina plegada en una forma laminar al seu interior.

The three-dimensional organization of the chromatin filament in metaphase chromosomes is one of the most challenging problems of structural biology. The most accepted structural models for chromatin organization in the metaphase chromosome are those that present the chromatin fibber as a basic unit. However, they were proposed by the use of low ionic strength buffers. Through the use of several microscopy techniques, it was observed that metaphase chromosomes were built by a new structural element: the chromatin plate. The main goal of this thesis was to gain further insight on internal structure of metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Firstly, it was analysed the entire chromosome structure within the cell using polarizing microscopy; and secondly, it was analysed the assembly process of digested chromatin fragments from human metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Through the use of polarizing microscopy, it was observed that metaphase chromosomes in aqueous solutions under different ionic conditions are optically isotropic. These results exclude the possibility that nucleosomes are oriented regularly forming parallel columns inside metaphase chromosomes. Despite of this, it does not exclude the face-to-face and lateral side-by-side interactions of different nucleosomes, that can already generate columns with several orientations. The results obtained in the self-assembly process of chromatin fragments obtained after the digestion of micrococcal nuclease of human metaphase chromosomes observed with transmission electron microscopy, showed that they appear to be in an extended conformation just under low ionic strength condition (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). When fragments are treated under metaphase ionic conditions (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), it was observed that chromatin filaments generate laminar structures. In addition, there is no presence of chromatin fibbers. Self assembled plates show the same structural properties than the ones that emanate directly from metaphase chromosomes (i.e., flat and smooth surface, well-defined edges, stacking of several layers). Furthermore, the height of the plates obtained by self-assembly determined in unidirectional shadowing experiments is 6.8 ± 1.0 nm. This value is equal to the height of the plates emanated from partially denatured chromosomes, which was observed previously in our group. The presence of thick plates in the experiments performed at 25 and 37ºC indicate that the self assembled plates can be formed by stacked layers. Circular structures of 30 nm were observed surrounding the plates but also closely associated with them. Their presence suggested that these structures are intermediates of the plate generation process. Taking into account that the nucleosome height is 11 nm and that there are no evidences that suggest the presence of nucleosome columns inside the plates, results indicate that nucleosomes are slightly inclined in the chromatin plates. In conclusion, the results obtained in this thesis suggest that there is an irregular orientation of the nucleosomes inside the chromatin plates. The interdigitation of adjacent layers allows face-to-face and lateral side-by-side interactions between nucleosomes of successive layers, which confers stability and compactness to the laminar structure. The metaphase chromatin tendency to generate multilayered stable structures after a self-assembly process suggests that chromatids are composed of chromatin folded in a laminar way