Identificación y expansión de progenitores hematopoyéticos humanos

Abstract

En la actualidad el trasplante de médula ósea es el tratamiento de elección para numerosas neoplasias hematológicas y para algunas inmunodeficiencias severas. La presencia de precursores y de células maduras de distintos linajes en el injerto resulta beneficiosa para luchar contra las infecciones post-transplante e incluso en la erradicación del tumor. La sangre de cordón umbilical se ha convertido en una fuente importante de células madre hematopoyéticas para su uso en el tratamiento de enfermedades hematológicas en adultos, debido a su disponibilidad, a que permite una mayor disparidad en la compatibilidad de HLA, y presenta una menor incidencia de enfermedad de injerto contra el huésped. Sin embargo, la mayor limitación para su uso en el trasplante de progenitores hematopoyéticos, es que presenta un bajo número de progenitores hematopoyéticos. Dada la relación entre cantidad de células madre infundidas y el éxito del procedimiento, es necesario el desarrollo de métodos para inducir la proliferación de estos progenitores. La expansión de células madre hematopoyéticas requiere un paso previo de identificación y purificación. Se ha visto que la caracterización fenotípica que se ha venido utilizando (Lin-CD34+), define una población heterogénea de progenitores hematopoyéticos. En este trabajo, utilizando los marcadores identificados en ratón, se caracterizó la población CD34+CD38-CD150+CD135- de sangre de cordón umbilical. Diferentes ensayos funcionales, demostraron que esta población está formada por progenitores multipotenciales, con capacidad de automantenimiento y de reconstitución del sistema hematopoyético. Esta población compartía las características que definen a las células madre hematopoyéticas y además presentaba una baja tasa de proliferación tanto in vitro como in vivo. Lo que sugiere que está formada por células en un estado quiescente. Para conseguir la expansión de progenitores, inicialmente se utilizaron diferentes combinaciones de citocinas (IL-6, SCF, TPO y FLT-3). Aunque con estos tratamientos se inducía una intensa proliferación, ésta se veía acompañada de diferenciación. Con el objetivo de reducir los procesos de diferenciación durante la expansión, se estudió el efecto del estroma, la activación de la vía de Notch y la adición de un modificador epigénetico, el ácido valproico. Se observó que el cultivo de progenitores hematopoyéticos con células estromales que inducen la activación de la vía de Notch, aumentaba la proliferación reduciendo la diferenciación. El ácido valproico inducía efectos similares a los anteriores activando la expresión de Hes1, mediante un mecanismo dependiente o independiente de la vía de Notch. Ambos estudios muestran como las señales externas del microambiente en el que se encuentran los progenitores hematopoyéticos, provocan la salida del estado de quiescencia, activando e induciendo su proliferación.

Over the last decade the use of umbilical cord blood as a source of hematopoietic stem cells (HSC) has increased due to its quick availability and because it allows the usage of mismatched donors, thus reducing the risk of graft versus host disease. However, one major limitation of umbilical cord blood as an HSC therapy is the low cell dose available for transplantation. Hematopoietic stem cells are defined by their capacity to self-renew and reconstitute the entire blood system of a transplanted recipient. In mouse, the use of cell surface markers has allowed an accurate HSC isolation by fluorescence activated cell sorting (FACS). However, human HSC population is still unestablished. It has been described that the combination of the well known Lin- LSK mouse HSC and the SLAM family markers can refine cell hierarchies within mouse HSC population. We have used CD150 and CD135 markers together with the classic CD34+CD38- population, to elucidate if these markers would also define a high enriched population of HSC with a high repopulating potential in humans. We have isolated the CD34+CD38-CD150+CD135- cord blood population and tested its hematopoietic stem cell potential. In vitro and in vivo assays have demonstrated that this population contains short and long-term HSC that can be differentiated into all blood lineages. We have demonstrated that these cells self-renew and reconstitute the hematopoietic system of a transplanted mouse. Moreover, we have observed that most of these cells remain in a quiescent state and they can be activated by culturing them on stromal cells with cytokines. One approach to overcome the obstacle of low cell dose observed in umbilical cord blood transplantation has been the attempt to expand HSC ex vivo. We have cultured hematopoietic stem cells on stromal cells that induce Notch pathway activation. We have also studied the effects of the addition of valproic acid, an epigenetic modifier, on HSC expansion. Hematopoietic stem cell culture on stromal cells that induce Notch pathway activation promote HSC proliferation thus reducing differentiation. Valproic acid treatment has similar effects to stromal culture and Notch activation on HSC. Moreover, VPA induces Hes1 expression by a Notch dependent or independent mechanism. Both studies conclude that hematopoietic stem cell quiescence can be reverted by environmental external signals. Thus activating and inducing proliferation on hematopoietic progenitors.