Acute phase proteins in wild boar, pyrenean chamois and spanish ibex: method validation and reference values

Abstract

Hi ha un grup de proteïnes plasmàtiques, anomenades proteïnes de fase aguda (PFAs), la concentració de les quals canvia quan es produeixen lesions tissulars induïdes per traumes o estrès i per condicions infeccioses i inflamatòries. La funció principal de les PFAs és recuperar la homeòstasi i limitar el creixement microbià. La quantificació de la concentració de les PFAs pot ser utilitzada com a eina pel diagnòstic i pronòstic, així com pel seguiment de tractaments. A la bibliografia hi ha molts articles que descriuen els diferents patrons de les proteïnes enfront diferents malalties. No obstant, la utilitat de les APPs i la seva dinàmica en malalties pròpies de poblacions salvatges no ha estat determinada. Els mètodes de laboratori que s’utilitzen actualment per mesurar les APPs s’haurien de validar abans de proporcionar cap resultat. Això és especialment important en les espècies salvatges, on les tècniques dels animals domèstics s’extrapolen sense validació prèvia, i per tant la fiabilitat dels resultats es desconeguda. Els objectius principals d'aquest treball són validar els mètodes analítics disponibles per la determinació de proteïnes de fase aguda en ungulats domèstics per al seu ús en ungulats salvatges, així com proporcionar valors de referència per a les espècies estudiades i verificar la utilitat d’aquestes proteïnes de fase aguda. En l’ESTUDI I, realitzat en el senglar, es va determinar la concentració sèrica de sis APPs: l’haptoglobina (Hp), el sèrum amiloide A (SAA), la proteïna C-reactiva (CRP) i la proteïna de fase aguda major de porcí (Pig-MAP) utilitzant kits comercials. Els kits de les dues últimes proteïnes mencionades dissenyats específicament per la seva aplicació en mostres de porcí. També es van determinar la glicoproteïna àcida soluble (ASG) i la ceruloplasmina (Cp) mitjançant mètodes analítics descrits prèviament. Tots els mètodes utilitzats van demostrar una bona precisió (CV <15%), excepte per les proteïnes ASG i SAA que van presentar coeficients de variació (CVs) entre anàlisis més alts. Aquests dos CVs van ésser obtinguts pel pool de concentració baixa. L’estudi d’interferència va demostrar que l’hemòlisi produeix interferència en totes les proteïnes estudiades, sobretot el SAA. Totes les proteïnes estudiades van presentar diferències significatives entre les concentracions d’animals sans i malalts. Els valors de referència obtinguts pels senglars sans van ser similars als descrits prèviament en altres treballs realitzats en el porc domèstic. En l’ESTUDI II es van comparar dos mètodes diferents per la determinació de la CRP en el senglar. Un mètode immunoturbidimètric (TIA) específic de humana amb un mètode immunoenzimàtic (ELISA) específic de porcí. També es va validar el mètode immunoturbidimètric per al seu ús en els senglars. La regressió Passing-Bablok va demostrar que hi havia un error proporcional entre TIA i ELISA. Aquest error es va reduir quan es va utilitzar un calibrador de porcí fabricat en el laboratori. La validació del TIA amb el calibrador de porcí obtingut al laboratori va demostrar tenir una bona precisió i una bona exactitud. Es va demostrar també que l’hemòlisi produeix interferències importants en l’anàlisi de la CRP amb mostres de senglar amb el TIA. La validació dels mètodes de la Hp, SAA, ASG i Cp pel seu ús en l’isard es va realitzar en l’ESTUDI III. En general, tots els mètodes van presentar bona precisió i exactitud. Les mostres procedents d'animals sans van produir molts valors per sota del límit de detecció establert per les proteïnes Hp i SAA. La ASG es va veure afectada significativament per l'hemòlisi. Els valors obtinguts d'animals sans i malalts van ser significativament diferents entre sí. Els mètodes de determinació de la Hp i el SAA van ser avaluats pel seu ús en la cabra salvatge en l’ESTUDI IV. Aquests mètodes van demostrar tenir bona precisió intra-assaig i bona exactitud. En l’estudi inter-assaig es va observar una gran imprecisió per ambdues proteïnes. La inflamació induïda amb la injecció de trementina va produir un canvi significatiu en la concentració de Hp i SAA. En canvi, la infecció experimental amb llengua blava no va produir canvis significatius en cap de les proteïnes estudiades. Els mètodes validats per la determinació de les PFA en aquests quatre estudis van demostrar que els resultats que produeixen son fiables i que per tant es poden aplicar en les espècies estudiades, amb l’excepció d'alguns paràmetres que caldria tenir en compte quan s’utilitzin aquests mètodes. De la mateixa manera, hi va haver diferències significatives entre els animals sans i malalts en totes les proteïnes estudiades en el senglar i l’isard, i en l’haptoglobina i l’amiloide A sèric en la cabra salvatge. En aquesta última espècie les dues proteïnes estudiades van produir canvis de concentració suficients com per poder discriminar bé entre abans i després de l'establiment d’una resposta inflamatòria induïda per la injecció de trementina.

Hay un grupo de proteínas plasmáticas, llamadas proteínas de fase aguda (PFAs), la concentración de las cuales cambia cuando se producen lesiones tisulares inducidas por traumas o estrés y por condiciones infecciosas e inflamatorias. La función principal de las PFAs es restablecer la homeostasis y limitar el crecimiento microbiano. La cuantificación de la concentración de las PFAs puede ser utilizada como herramienta para el diagnóstico y pronóstico, así como para el seguimiento de tratamientos. En la bibliografía hay muchos artículos que describen los diferentes patrones de las proteínas frente distintas enfermedades. Sin embargo, la utilidad de las APPs y su dinámica en enfermedades propias de poblaciones salvajes no ha sido determinada. Los métodos de laboratorio que se utilizan actualmente para medir las APPs deberían ser validados antes de proporcionar ningún resultado. Esto es especialmente importante en las especies salvajes, donde las técnicas de los animales domésticos se extrapolan sin validación previa, y por tanto la fiabilidad de los resultados es desconocida. Los objetivos principales de este trabajo son validar los métodos analíticos disponibles para la determinación de proteínas de fase aguda en ungulados domésticos para su uso en ungulados salvajes, así como proporcionar valores de referencia para las especies estudiadas y verificar la utilidad de estas proteínas de fase aguda. En el ESTUDIO I, realizado en el jabalí, se determinó la concentración sérica de seis APPs: haptoglobina (Hp), el amiloide A sérico (SAA), la proteína C-reactiva (CRP) y la proteína de fase aguda mayor de porcino (Pig-MAP) utilizando kits comerciales. Los kits de las dos últimas proteínas mencionadas diseñados específicamente para su aplicación en muestras de porcino. También se determinaron la glicoproteína ácida soluble (ASG) y la ceruloplasmina (Cp) mediante métodos analíticos descritos previamente. Todos los métodos utilizados demostraron una buena precisión (CV <15%), excepto para las proteínas ASG y SAA que presentaron coeficientes de variación (CVs) entre análisis más altos. Estos dos CVs fueron obtenidos para el pool de concentración baja. El estudio de interferencia demostró que la hemólisis produce interferencia en todas las proteínas estudiadas, sobretodo el SAA. Todas las proteínas estudiadas presentaron diferencias significativas entre las concentraciones de animales sanos y enfermos. Los valores de referencia obtenidos por jabalíes sanos fueron similares a los descritos previamente en otros trabajos realizados en el cerdo doméstico. En el ESTUDIO II se compararon dos métodos diferentes para la determinación de la CRP en el jabalí. Un método immunoturbidimètrico (TIA) específico de humana con un método immunoenzimàtico (ELISA) específico de porcino. También se validó el método immunoturbidimètrico para su uso en los jabalíes. La regresión Passing-Bablok demostró que había un error proporcional entre TIA y ELISA. Este error se redujo cuando se utilizó un calibrador de porcino fabricado en el laboratorio. La validación del TIA con el calibrador de porcino obtenido en el laboratorio demostró tener una buena precisión y una buena exactitud. Se demostró también que la hemólisis produce interferencias importantes en el análisis de la CRP con muestras de jabalí con el TIA. La validación de los métodos de la Hp, SAA, ASG y Cp para su uso en el rebeco se realizó en el ESTUDIO III. En general, todos los métodos presentaron buena precisión y exactitud. Las muestras procedentes de animales sanos produjeron muchos valores por debajo del límite de detección establecido para las proteínas Hp y SAA. La ASG se vio afectada significativamente por la hemólisis. Los valores obtenidos de animales sanos y enfermos fueron significativamente diferentes entre sí. Los métodos de determinación de la Hp y el SAA fueron evaluados para su uso en la cabra montés en el ESTUDIO IV. Estos métodos demostraron tener buena precisión intra-ensayo y buena exactitud. En el estudio inter-ensayo se observó una gran imprecisión para ambas proteínas. La inflamación inducida con la inyección de trementina produjo un cambio significativo en la concentración de Hp y SAA. En cambio, la infección experimental con lengua azul no produjo cambios significativos en ninguna de las proteínas estudiadas. Los métodos validados para la determinación de las PFA en estos cuatro estudios demostraron que los resultados que producen son fiables y que por tanto se pueden aplicar en las especies estudiadas, con la excepción de algunos parámetros que habría que tener en cuenta cuando se utilicen estos métodos. Del mismo modo, hubo diferencias significativas entre los animales sanos y enfermos en todas las proteínas estudiadas en el jabalí y el rebeco, y en la haptoglobina y el amiloide A sérico en la cabra montesa. En esta última especie las dos proteínas estudiadas produjeron cambios de concentración suficientes como para poder discriminar bien entre antes y después del establecimiento de una respuesta inflamatoria inducida por la inyección de trementina.

Acute phase proteins (APPs) are a group of plasma proteins that change in concentration after any tissue injury induced by infection, inflammation, trauma or stress. Their main function is to restore homeostasis and limit microbial growth. The quantification of APPs can be used as a tool for diagnostic and prognostic as well as to monitor treatments. In the literature there are many articles describing the APPs patterns against different diseases in domestic animals, mainly livestock. However, the usefulness of APPs and their dynamics in diseases typical of wild populations has not been characterized. Analytical validation of the laboratory methods in use for the determination of APP should be assessed before the report of any value. This is especially important in wild animals, in which often the techniques in use in domestic animals are extrapolated without prior validation, so that the reliability of the results is unknown. The main goals of the present thesis are to validate analytical methods available for determination of APPs in domestic ungulates for its use in wild ungulates, to provide reference values and to verify the utility of several APPs for the species studied. In STUDY I six different APPs in wild boar were studied: serum haptoglobin (Hp), serum amyloid A (SAA), C-reactive protein (CRP) and porcine major acute phase protein (Pig-MAP) concentrations were determined using commercial kits available, the last two were porcine-specific methods; Acid soluble glycoprotein (ASG) and ceruloplasmin (Cp) were analyzed using assay methods described previously in literature. All the methods demonstrated good precision (CVs<15%), except inter assay CVs for ASG and SAA with the low concentration pool. Hemolysis affected all the proteins studied, mostly the SAA. There were significant differences between healthy and diseased animals. Reference ranges obtained for healthy wild boars were similar to those reported previously in literature for domestic pigs. In STUDY II a human CRP turbidimetric immunoassay (TIA) was compared to the porcine specific enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) CRP and validated for its use in wild boar. Passing bablok regression demonstrated that there was a proportional error between TIA and ELISA which was reduced using a porcine in-house calibrator. The validation of TIA CRP with the porcine in-house calibrator showed good precision and accuracy. Important interference was observed in the study of hemolysis. The method validation of Hp, SAA, ASG and Cp conducted in STUDY III in Pyrenean chamois demonstrated good precision and accuracy of all the proteins studied. Hp and SAA yielded many values below the limit of detection when samples from healthy animals were analyzed. ASG was significantly affected by hemolysis. The values obtained from healthy and diseased animals were significantly different from each other. Hp and SAA methods were evaluated for Spanish ibex in STUDY IV with good intra-assay precision and accuracy. An important inter-assay imprecision was observed for both proteins. Inflammation induced by turpentine injection produced a significant change in the concentration of Hp and SAA. No significant changes in any of the proteins studied were observed when a experimentally bluetongue virus infection was induced. APPs methods validated in these studies demonstrated to be reliable in the species studied, except for some parameters that should be kept in mind when implementing these methods. Likewise, significant differences between healthy and disease animals were observed for all the proteins studied in wild boar and Pyrenean chamois. In Spanih ibex, haptoglobin and serum amyloid A discriminated well before and after the establishment of an aseptic inflammation induced by turpentine injection.