Identificación de biomarcadores plasmáticos de bienestar en el ganado porcino mediante la aplicación de técnicas proteómicas

Abstract

El benestar animal és un problema de gran importància en el món de la ramaderia actual a causa de la seva relació amb la seguretat i qualitat alimentària, amb implicacions legislatives i econòmiques. No obstant, els criteris actuals per avaluar el grau de benestar d’un animal encara estan lluny de ser suficientment objectius i específics. El descobriment de nous marcadors o d'un perfil de marcadors relacionats amb el benestar permetria millorar la prevenció i el tractament de les malalties, i optimitzar el maneig i la productivitat dels animals de granja. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat la cerca de biomarcadors plasmàtics de benestar en tres situacions a les que estan exposats habitualment els porcs durant la seva etapa productiva a les granges d'explotació porcina: l'elevada densitat d'estabulació, l'allotjament en gàbies individuals amb fins reproductius (pràctica prohibida a Espanya des del gener de 2013) i la infecció pel circovirus porcí 2 (PCV2). A conseqüència de la innovació i el desenvolupament de les tecnologies -òmiques, que permeten fer un anàlisi massiu de les molècules presents en una cèl·lula, teixit o fluid en un moment determinat, la cerca de nous biomarcadors ha pres un fort impuls i s’ha convertit en un dels objectius de més interés per als investigadors. El suport bibliogràfic i l'anàlisi diferencial mitjançant 2-DE DIGE i iTRAQ del proteoma sanguini dels animals sotmesos a les dues primeres situacions de pobre benestar ha permès proposar un perfil de benestar porcí de laboratori basat en la quantificació de: 1) cortisol en sèrum i saliva; 2) paràmetres relacionats amb el metabolisme dels lípids (colesterol i les seves partícules transportadores, àcids grassos i triglicèrids); 3) indicadors de l'estat de salut de l'animal (marcadors musculars, hepàtics, renals i immunoglobulines); 4) proteïnes de fase aguda (haptoglobina, Pig-MAP i apolipoproteïna A-I) i altres components del sistema immune innat (pèptids antimicrobians); 5) marcadors d'estrès oxidatiu (glutatió peroxidasa, superòxid dismutasa, glutatió total, peroxiredoxina 2 i grups carbonil de les proteïnes oxidades), 6) proteïnes estructurals del citosquelet; i 7) proteïnes de xoc tèrmic. A més, s'han caracteritzat estructuralment les isoformes proteiques de l'haptoglobina i l'apolipoproteïna A-I mitjançant espectrometria de masses en tàndem. Per una banda, es van detectar cadenes glucídiques de tipus N- i O- a les quatres isoformes principals de la cadena β de l'haptoglobina, mentre que les tres isoformes de l'apolipoproteïna A-I estaven oxidades. Així mateix, es va observar un comportament diferent entre les tres isoformes de l'apolipoproteïna A-I en els porcs infectats pel virus PCV2: la isoforma que correspon a la preproteïna va augmentar i les altres dos van disminuir. En canvi, la freqüència relativa de les isoformes de la cadena β i α de l'haptoglobina no va variar. Per una altra banda, s'ha iniciat la posta a punt d'una tècnica quantitativa basada en espectrometria de masses, el SRM, per a la mesura d'algunes proteïnes de fase aguda porcines com ara l'haptoglobina, la Pig-MAP, l'apolipoproteïna A-I i la glicoproteïna α2-Heremans Schmid. Aquesta tecnologia s’està erigint com una bona alternativa a l’ús dels reactius comercials, que no solen presentar reactivitat contra les proteïnes d'origen porcí.

El bienestar animal es un problema de gran importancia en el mundo de la ganadería actual debido a su relación con la seguridad y calidad alimentaria, con implicaciones legislativas y económicas. Sin embargo, los criterios actuales para evaluar el grado de bienestar aún están lejos de ser lo suficientemente objetivos y específicos. El descubrimiento de nuevos marcadores o de un perfil de marcadores relacionados con el bienestar permitiría mejorar la prevención y el tratamiento de las enfermedades, y optimizar el manejo y la productividad de los animales de granja. El objetivo principal de esta tesis ha sido la búsqueda de biomarcadores plasmáticos de bienestar en tres situaciones a las que están expuestos habitualmente los cerdos durante su etapa productiva en las granjas de explotación porcina: la elevada densidad de estabulación, el alojamiento en jaulas individuales con fines reproductivos (práctica prohibida en España desde enero del 2013) y la infección por el circovirus porcino 2 (PCV2). A consecuencia de la innovación y el desarrollo de las tecnologías –ómicas, que permiten realizar un análisis masivo de las moléculas presentes en una célula, tejido o fluido en un momento determinado, la búsqueda de nuevos biomarcadores ha tomado un fuerte impulso y se ha convertido en uno de los objetivos de mayor interés para los investigadores. El soporte bibliográfico y el análisis diferencial mediante 2-DE DIGE e iTRAQ del proteoma sanguíneo de los animales sometidos a las dos primeras situaciones de pobre bienestar ha permitido proponer un perfil de bienestar porcino de laboratorio basado en la cuantificación de: 1) cortisol en suero y saliva; 2) parámetros relacionados con el metabolismo de los lípidos (colesterol y sus partículas transportadoras, ácidos grasos y triglicéridos); 3) indicadores del estado de salud del animal (marcadores musculares, hepáticos, renales e inmunoglobulinas); 4) proteínas de fase aguda (haptoglobina, Pig-MAP y apolipoproteína A-I) y otros componentes del sistema inmune innato (péptidos antimicrobianos); 5) marcadores de estrés oxidativo (glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión total, peroxiredoxina 2 y grupos carbonilo de las proteínas oxidadas), 6) proteínas estructurales del citosqueleto; y 7) proteínas de choque térmico. Además, se han caracterizado estructuralmente las isoformas proteicas de la haptoglobina y la apolipoproteína A-I mediante espectrometría de masas en tándem. Por un lado, se detectaron cadenas glucídicas de tipo N- y O- en las cuatro isoformas principales de la cadena β de la haptoglobina, mientras que las tres isoformas de la apolipoproteína A-I estaban oxidadas. Asimismo, se observó un comportamiento diferente entre las tres isoformas de la apolipoproteína A-I en los cerdos infectados por el virus PCV2: la isoforma que corresponde a la preproteína aumentó y las otras dos disminuyeron. En cambio, la frecuencia relativa de las isoformas de la cadena β y α de la haptoglobina no variaron. Por otro lado, se ha iniciado la puesta a punto de una técnica cuantitativa basada en espectrometría de masas, el SRM, para la determinación de algunas proteínas de fase aguda porcinas como la haptoglobina, la Pig-MAP, la apolipoproteína A-I y la glicoproteína α2-Heremans Schmid. Esta tecnología se está erigiendo como una buena alternativa al uso de reactivos comerciales, que no suelen presentar reactividad contra las proteínas de origen porcino.

Animal welfare is an issue of great importance due to its relationship with food safety and quality, and its legislative, economic, ethical and public opinion implications. However, the current criteria for assessing the degree of animal welfare are still far from being sufficiently objective and specific. The discovery of new markers or combination of markers associated to welfare would improve the prevention and treatment of diseases, and optimize the management and productivity of farm animals. The main aim of this thesis was the search for new serum biomarkers in three common situations in the pig farm which adversely affect the well-being of the animals: the high density housing, the accommodation in individual cages for breeding purposes (practice banned in Spain since January 2013) and the infection with porcine's circovirus 2 (PCV2). As a result of the innovation and development of the -omics technologies, which allow a massive analysis of the molecules present in a cell, tissue or fluid at a given time, the search for new biomarkers has taken a strong run and has become one of the most common goals among researchers. Bibliographical support and experimental analysis of differential serum proteome of animals subjected to these two first situations of poor welfare with 2-DE DIGE and iTRAQ has led to propose a profile of laboratory-based parameters based on 1) cortisol in serum and saliva; 2) lipid metabolism parameters (cholesterol and its transporting particles, fatty acids and triglycerides), 3) indicators of the health of the animal (muscle, liver and kidney markers and immunoglobulins), 4) acute phase proteins (haptoglobin, Pig-MAP and apolipoprotein AI) and other components of the innate immune system (antimicrobial peptides), 5) oxidative stress markers (glutathione peroxidase and total glutathione, superoxide dismutase, peroxiredoxin 2 and carbonyl groups of the oxidized proteins) 6) filamentous cytoskeletal proteins; and 7) heat shock proteins. Moreover, we characterized the haptoglobin and apolipoprotein A-I protein isoforms with tandem mass spectrometry. On one hand, we detected N- and O-glycan chains in the four main isoforms of the haptoglobin β chain, while the three isoforms of apolipoprotein A-I were oxidized. Furthermore, we observed a different behaviour between the three isoforms of apolipoprotein A-I in pigs infected with PCV2: the isoform corresponding to the preprotein increased and whereas the other two decreased. However, the relative frequency of the β and α chain haptoglobin isoforms did not change. On the other hand, we optimized a quantitative method based on mass spectrometry to measure several acute phase proteins as haptoglobin, Pig-MAP, apolipoprotein A-I and α2-Heremans Schmid glycoprotein. SRM is being set up as a good alternative to the use of commercial reagents, which many times have a poor reactivity against proteins of porcine origin.