Structural and Fumctional Analysis of the SUMO Proteases SENP6 and SENP7

Abstract

Intercambiar la especifidad de las isoformas de SUMO1 y SUMO2/3 para SENP6/SENP7 SENP6 y SENP7 son los miembros más divergentes de la familia de proteasas SENP y los únicos miembros que llevan cuatro inserciónes o “loops” localizadas en su dominio catalítico. Al sobreponer el dominio catalítico de SENP7 sobre el complejo SENP2-SUMO podemos ver una posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO. También identificamos diferentes residuos de SUMO1 y SUMO2 que podrían formar parte de la interfaz. Diseñamos una serie de mutantes de SUMO1 y SUMO2 donde se intercambian entre ellos los residuos que forman parte de la interfaz. De esta manera fuimos capaces de intercambiar la actividad proteolítica de SENP6 y SENP7 hacia estos substratos. El Loop1 de SENP6 y SENP7 es responsable de la especificidad de la interfaz entre los SUMOs y las SENP6/7 Diseñamos una serie de mutantes del Loop1 de SENP7 dentro de la posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO para determinar los papeles estructurales y funcionales de los residuos que están dentro de esta región. Los mutantes de SENP6/7 sin el Loop1 perdían gran parte de su actividad, esta se podía recuperar un poco al reemplazar las cuatro prolinas del Loop1 por glicinas. De esta manera probamos que el Loop1 tiene un papel por lo menos estructural en el reconocimiento de SUMO. También identificamos el residuo Lys691 del Loop1 de SENP7 como elemento indispensable en la actividad de la enzima ya que al mutar este residuo por un aspártico disminuye la actividad para sustratos con SUMO2. Por otra parte el residuo Asp71 de SUMO2 es uno de los residuos propuestos para el reconocimiento de SUMO2/3. Cuando mutamos este residuo a lisina, vemos una bajada en la actividad de SENP7. Este hecho sugiere que Asp71 de SUMO2 está interaccionando con Loop1 y quizas con la Lys691, y que la bajada en la actividad es causada por una repulsión de cargas. Por otro lado con el objectivo de estudiar el efecto de Loop1 en la desconjugación de especies SUMOyladas, insertamos los ocho residuos de SENP6 Loop en el dominio catalítico de SENP2. Esta inserción provoca un aumento de la actividad sustancial de SENP2 contra diSUMO en comparación con la forma wild type. Complejos con substratos Para ver si SENP6 es capaz de formar algún complejo estable, producimos cantidades en miligramos de los mutantes inactivos de Δ3SENP6C1030S y de Δ2Δ3SENP6C1030S. Incubamos cada proteasa con los precursors de SUMO, con RanGAP1-SUMO2 y con diSUMO2. De todos los substratos que probamos, diSUMO2 fue el único que podía formar un complejo estable con Δ3SENP6CS y Δ2Δ3SENP6CS por copurificación en una columna de gel fitración. Con Δ2SENP6CS no pudimos formar ningún complejo. Con esta información llegamos a la conclusión que el Loop3 de SENP6 reduce, quizá por razones de entropía, la capacidad de SENP6 de formar un complejo estable con diSUMO2. Caracterización del Loop3 de SENP6 Para descifrar el papel que este loop tiene en el contexto de la proteasa, producimos y purificamos los 185 residuos de Loop3 de SENP6. Análysis 1-H 1-D RMN mostraba una falta de estructura terciaria dentro del loop, pero proteólisis limitada y espectroscopia de masas mostraban un fragmento estable de cerca de 11kDa. Dicroísmo circular y FTIR tambien sugieren la presencia de algunos elementos de estructura secundaria. Globalmente, la caracterización biofísica del Loop3 de SENP6 muestra que el loop es una proteína desestructurada.

Swapping the SUMO Isoform Specificity of SENP6/7 SENP6 and SENP7 are the most divergent members in the SENP family of proteases and they are the only members that bear four loop insertions dispersed throughout their catalytic domains. The superposition of the SENP7 catalytic domain with the SENP2-SUMO complex revealed a tentative SENP7 Loop1-SUMO interface and upon further inspection, distinct residues on SUMO1 and SUMO2 were identified at the interface. A series of mutants were constructed bearing characteristics of both SUMOs and by swapping the residues from SUMO1 to SUMO2 and vice versus we were able to both decrease and increase the activity of the SENP6 and SENP7 toward these substrates. Loop1 SENP6/7 Is Responsible For SUMO Interface Specificity In addition to mutations on SUMO we constructed a series of mutations on SENP7-Loop1 within the tentative SENP7-Loop1-SUMO interface to determine the structural and functional roles of the residues that reside within this region. We were able to recover some of the activity lost by the removal of Loop1 by replacing the four prolines of Loop1 with glycines proving that Loop1 plays at least a structural role in SUMO recognition. We also identified Lys691 of Loop1 in SENP7 as indispensible to the activity of the enzyme. D71 is one of the residues proposed to confer SUMO2/3 specificity in the previous swapping experiments. We mutated this residue in diSUMO2 and saw a decrease in activity of SENP7. This could be explained by our theory that this region on SUMO is interacting with Loop1, more specifically K691, and the decrease in activity was caused by a charge clash between SUMO2 and SENP7 Loop1. To further show the utility of Loop1 in deconjugation of multi-SUMOylated species we inserted the eight residues of SENP6 Loop1 into SENP2. We saw an overall increase in activity of SENP2 against diSUMO2 but not against any other substrate tested. Complexes With Substrates In order to see if SENP6 was able to form any stable complexes in solution, we produced milligram amounts of Δ3SENP6CS and Δ2Δ3SENP6CS (the two constructs of the protein that showed both good yields in protein production and high performance in activity assay). We incubated each protease with SUMO precursors, RanGAP1-SUMO2 and diSUMO2 substrates. Of all the substrates tested, only diSUMO was able to form a stable complex with Δ3SENP6CS and Δ2Δ3SENP6CS. Δ2SENP6CS was also tested but there was no indication of any complex formation, leading to the hypothesis that SENP6 Loop3 was impeding, perhaps entropically, the ability of SENP6 to form a stable complex with diSUMO2. SENP6 Loop3 Characterization Loop3 takes up roughly 40% and 20% of the catalytic domains of SENP6 and SENP7 respectively. In our loop deletion experiments we saw an overall increase in the activity when Loop3 was not present and removal of Loop3 proved vital to the ability of the enzyme to form a stable complex with diSUMO2. In order to try to decipher what role this loop plays in the context of the protease, we isolated the 184 insert from SENP6 and produced and purified the protein. 1-H 1-D NMR pointed to an overall lack of tertiary structure within the loop but limited proteolysis and mass spectrometry analyses showed a stable fragment of around 11kDa. Further circular dichroism and Fourier Transform Infrared Spectroscopy suggested the presence of some secondary structural elements but overall characterization of SENP6 Loop3 showed a mainly unstructured loop.