Estrategias de inmovilización de anticuerpos para la detección directa de hormonas mediante Inmunosensores de Resonancia de Plasmón Superficial

Abstract

En este trabajo de tesis se han desarrollado distintas estrategias para la inmovilización controlada de anticuerpos sobre la superficie sensora de dispositivos biosensores de Resonancia de Plasmón Superficial. Estos inmunosensores se han aplicado en la determinación de las hormonas hTSH y hGH, ambas de vital importancia en el desarrollo y crecimiento del individuo. El objetivo principal ha sido maximizar la eficiencia del proceso de inmovilización del anticuerpo, controlando la orientación y densidad del mismo sobre la superficie, para obtener un inmunosensor de alto rendimiento. El contenido de esta tesis se ha dividido en tres bloques distintos. En el primero de ellos se ha descrito el desarrollo de un método que presenta un gran potencial en el control de dopaje con hGHr, que es idéntica a la isoforma de la hGH de 22kDa, fracción de la hormona biológicamente activa. La relación entre los niveles de esta y de la isoforma de 20kDa es indicadora de la presencia de hGHr. Haciendo uso del sistema biotina/estreptavina para la inmovilización del anticuerpo se ha desarrollado un inmunoensayo para la detección simultánea de ambas isoformas, uno de los grandes retos en el desarrollo de tests antidoping, que por el momento requieren dos ensayos independientes. La segunda sección del trabajo se ha centrado en el desarrollo de un método novedoso para la inmovilización de anticuerpos, basado en el uso de una proteína de fusión. Se ha utilizado el par BSA/antiBSA como sistema modelo para optimizar las condiciones del método, y finalmente, este se ha empleado en un inmunoensayo para la determinación de la hGH de 22 kDa. Se ha demostrado la utilidad de la proteína para conseguir llevar a cabo una inmovilización orientada del anticuerpo, de una manera muy sencilla, y reduciendo al máximo el uso de material y tiempo empleado durante el inmunoensayo. Finalmente, en el tercer bloque se ha desarrollado un inmunosensor para el diagnóstico del Hipotiroidismo Congénito Neonatal (HCN). Se han explorado dos vías distintas en la funcionalización de la superficie sensora, una de ellas basada en la optimización de la metodología empleada en el desarrollo del inmunoensayo para la detección de las isoformas de la hGH. Como segunda estrategia se ha desarrollado un método inmovilización basado en el uso de la proteína G. Los inmunosensores desarrollados han permitido la detección en suero de niveles de 1,2 ng/mL en el caso de la hTSH, valor por debajo del nivel de corte para el diagnóstico de HCN, y de 0,9 ng/mL en el caso de la hGH de 22 y 20 kDa, valor inferior a los niveles basales de hGH 22K (~ 1,1 ng/mL) y superior a los de la hGH 20K (~ 0,11 ng/mL). Estos resultados indican que el inmunosensor desarrollado para la detección de hTSH tendría utilidad en el diagnóstico de HCN. Respecto al inmunosensor desarrollado para la detección de las isoformas de la hGH, aunque la aplicación del mismo en el análisis anti-doping estaría limitada por la reducción que experimenten los niveles circulantes de la hGH 20K tras la administración de la hormona (por un mecanismo de control por retroalimentación negativa), el inmunoensayo permite calcular la relación hGH 22K:hGH 20K, parámetro indicador de dopaje con hGHr.

This thesis focused on the development of different strategies for the site-directed immobilization of antibodies on the sensor surface of Surface Plasmon Resonance devices. These immunosensors were applied in the determination of the hTSH and hGH hormones, which play a crucial role in the human growth and development. The main goal was to maximize the efficiency of the antibody immobilization procedures, controlling its orientation and density on the sensor surface, in order to achieve high performance immunosensors. The content of this work is divided in three sections. In the first one, the development of a method with a great potential in the detection of doping with hGHr, which is identical to the hGH isoform of 22kDa, the biologically active isoform. The ratio between this variant and the one of 20 kDa, is a biomarker parameter of the hGH doping. By using the biotin/streptavidin system for the antibody immobilization, an immunoassay for the simultaneous determination of both isoforms were developed, one of biggest challenges in the development of tests antidoping, which at the moment require two assays. The second section of the work focused on the development of a novel method for the immobilization of antibodies, based on the use of a fusion protein. The pair BSA/anti-BSA was used as model system for the optimization of the method conditions, and finally, it had been employed in an immunoassay for the determination of the 22 kDa hGH isoform. The utility of this protein for the achievement of an oriented immobilization of the antibodies in a simple way whilst consuming only tiny amounts of reagents and time was demonstrated. Finally, in the third section an immunosensor for the diagnosis of Neonatal Congenital Hypothyroidism (CH) was developed. Two approaches have been explored for the functionalization of the sensor surface, one of them based on the optimization of the methodology used for the development of the hGH isoforms immunoassay. The second strategy employed was based in the use of the protein G. The immunosensors developed in this work allowed the detection in serum of 1.2 ng/mL of hTSH, below the cut-off value for the diagnosis of CH, and 0.9 ng/mL of 22 kDa hGH and 20 kDa hGH, below basal levels of the 22 kDa isoform (~ 1.1 ng/mL), and above basal levels of the 20 kDa (~ 0.11 ng/mL). These results demonstrate the potential clinical application of the immunosensor developed for the detection of hTSH. Regarding the immunosensor developed for the detection of the hGH isoforms, although its application in anti-doping analysis would be limited by reduction of the 20K isoform after hGH administration (due to a negative feedback mechanism), the immunoassay allows the calculation of the hGH 22K:hGH 20K ratio, biomarker parameter of hGH doping.