De novo design of self-assembling protein nanoparticles towards the gene therapy of colorectal cancer

Abstract

Hoy en día, el cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en el mundo. Por lo tanto, existe una gran necesidad de encontrar nuevas terapias que resulten más efectivas para su tratamiento. Las terapias actuales, lejos de ser efectivas, producen una gran toxicidad sistémica y ofrecen un bajo porcentaje de supervivencia a los pacientes, siendo la principal causa de muerte la aparición de focos metastáticos, especialmente en el cáncer de colon. Por lo tanto, mejorar la especificidad celular y evitar la aparición de focos metastaticos son los mayores retos a los que se enfrentan las futuras terapias contra el cáncer. En este contexto, la terapia génica aparece como una alternativa muy prometedora ya que ofrece la posibilidad de personalizar las terapias además de disminuir su toxicidad. Dado que la bioseguridad es uno de los parámetros que más preocupa en este tipo de terapias, las proteínas multifuncionales aparecen como uno de los vectores de terapia génica más prometedores no solo por su alta biocompatibilidad y su baja toxicidad, sino también por su gran plasticidad. Por otro lado, la necesidad de controlar el tamaño de las partículas generadas para conseguir una adecuada biodistribucion in vivo ha sido ampliamente descrita en la literatura. En este trabajo, hemos explorado la posibilidad de modular el autoensamblaje de proteínas multifuncionales en nanoparticulas de un tamaño predefinido con tal de obtener el máximo potencial de su capacidad de entrega de ácidos nucleicos o drogas terapéuticas. En este contexto, hemos descrito parejas de tags arquitectónicos (de los cuales uno de ellos es una poli-histidina) que son capaces de inducir el autoensamblaje de las proteínas que las contienen en nanoparticulas con propiedades estructurales predefinidas. También hemos estudiado la interacción y el traffiking intracelular de estas nanoparticulas cuando las ponemos en contacto con células en cultivo, donde hemos visto que su internalización no resulta toxico para las células de mamíferos. Además, también hemos estudiado la estabilidad estructural que presentan estas nanoparticulas cuando se administra por vía intravenosa en modelos de ratón, mostrando que las interacciones intermoleculares que se generan durante el proceso de ensamblaje de las nanoparticulas in vitro, son suficientemente fuertes como para asegurar su estabilidad estructural in vivo. Se ha descrito que el receptor CXCR4 es un elemento clave en la formación de focos metastaticos durante el desarrollo tumoral de diferentes tipos de cáncer incluyendo el cáncer de colon, para el cual actualmente no existe todavía ningún vehículo que reconozca de forma específica las células metastaticas. En este contexto, en este estudio hemos explorado la posibilidad de funcionalizar las nanoparticulas proteicas con ligandos que reconocen el receptor CXCR4 con tal de dirigirlas de forma específica a las células que expresan este receptor. Entre los ligandos testados, hemos visto que el péptido T22 es un ligando inusualmente eficiente para el reconocimiento selectivo e internalización en células que expresan el receptor CXCR4 y que las nanoparticulas funcionalizadas con este ligando se biodistribuyen de forma selectiva a las células CXCR4+ in vivo en modelos murinos de cáncer colorectal. Finalmente, también hemos explorado la posibilidad de usar nanoparticulas proteicas funcionalizadas como virus artificiales para la entrega especifica de ácidos nucleicos en las células diana. Este trabajo muestra como las nanoparticulas que contienen dominios de unión a ácidos nucleicos, cuando son incubados junto a un DNA externo, son capaces de generar estructuras que imitan las estructuras virales, encapsulando el DNA en la parte interna de las estructura y protegiéndolo a su vez del ataque de nucleasas externas. Sin embargo, es necesario añadir un paso de hidrolisis con DNasa y RNasas en la purificación de nanoparticulas que contienen dominios de unión a ácidos nucleicos ya que se ha visto que unen ácidos nucleicos bacterianos provenientes del sistema de expresión bacteriano utilizado para su producción recombinante, afectando muy negativamente sobre su funcionalidad como virus artificiales. Por lo tanto, dado la gran biocompatibilidad que a priori se espera de las proteínas, sus propiedades arquitectónicas regulables y la posibilidad de funcionalizarlos con ligandos específicos, hace que las nanoparticulas proteicas autoensamblables sean una herramienta muy prometedora para la entrega dirigida de ácidos nucleicos y drogas terapéuticas en las células de cáncer metastatico de colon y en general en las células de mamífero.

Cancer is ranked as the second leading cause of death worldwide. Consequently there is a huge necessity of finding more effective cancer therapies. Currently available cancer therapies, far from being effective, present high systemic toxicity and low patient survival rates being the main mortality cause the appearance of metastatic foci, especially in colon cancer. Thus, improving cell specificity and avoiding metastases generation are the mayor challenges for future cancer therapies. In this context, gene therapy appears as very promising alternative therapy since cell targeted personalized therapies can be performed with low systemic toxicity. Since biosafety is the current mayor concern in this type of therapies, multifunctional proteins appear as the most promising gene therapy vectors because of their high biocompatibility and biosafety, low toxicity and really complete tuneability. Moreover, the necessity of effectively controlling nanoparticles size for their efficient biodistribution and delivery has been widely described in the literature. In the present work has been explored the possibility of effectively modulating the self-assembling of multifunctional protein building blocks into predefined size distribution nanoparticles in order to get the full potential of those protein-only nanoparticles for their application in therapeutic drugs and nucleic acids delivery approaches. In this regard, we have described cationic architectonic tag pairs ( one of them being a poly-histidine) that when incorporating to proteins, they induce the self-assembling of protein monomers into nanoparticles with predefined structural properties. It has also been studied the interaction and intracellular trafficking of these kind of protein nanoparticles in cultured cells proving not to be toxic for mammalian cells. Moreover, the structural stability of generated nanoparticles upon intravenous administration in mice has been also studied proving in vitro generated intermolecular interactions during protein assembling process strong enough to ensure nanoparticles structural stability in vivo. It has been shown that CXCR4 chemoquine receptor is a key element in metastasis formation during cancer evolution in different types of tumors, including colorectal cancer, for which metastatic intracellular targeting vehicles are currently missing. In this context, the possibility of effectively functionalizing protein nanoparticles with CXCR4 specific ligands has been deeply explored in this study. Among tested peptide ligands, T22 peptide has shown to be an unusually powerful tag for selective intracellular targeting in CXCR4+ cells having T22-empowered protein nanoparticles of optimal size selectively biodistribute in CXCR4+ cells in vivo. Finally, the suitability of functionalized self-assembling protein nanoparticles for their use as artificial viruses has been also extensively explored. Protein nanoparticles that contain nucleic acid binding domains have shown an appealing capacity to generate virus-like structures when combined with external DNA, completely shielding cargo DNA in the inner part of the structure and protecting it from external nucleases hydrolysis. However, the necessity of an additional DNase/RNase hydrolysis treatment during the nanoparticles purification process has been described since nanoparticles with nucleic acid binding domains have been shown to bind nucleic acids from the bacterial host used for their recombinant expression, resulting strongly detrimental for their functionality as artificial viruses. All together, the high biocompatibility expected for proteins, their regulatable architectonic properties and their efficient targeting possibility, make self-assembling protein-only nanoparticles a very promising material for the therapeutic delivery of drugs and nucleic acids in metastatic colorectal cancer cells and in general in mammalian cells.