New Approaches for the Induction of Tolerance in Transplantation: Evaluation of Exosomes and Tolerogenic Dendritic Cells

Abstract

Tras el trasplante, el sistema inmunitario se activa para inducir una respuesta inmunitaria contra los antígenos de histocompatibilidad del donante expresados por el injerto (alo-antigenos), que conduce al rechazo del órgano. Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígeno más potentes y tiene un papel fundamental en la iniciación de la respuesta inmunitaria contra el injerto mediante la presentación de aloantígenos a las células T a través de varias vías. No obstante, las CD son también participantes clave en la inducción de tolerancia. Uno de los principales objetivos en el trasplante es la inducción de tolerancia específica de donante evitando de este modo la administración crónica de inmunosupresión, que tiene muchos efectos secundarios. La comprensión de los mecanismos inmunológicos implicados en el rechazo del trasplante ha permitido la generación de terapias alternativas a la inmunosupresión convencional. En diferentes modelos animales, se han empleado varias estrategias para inducir la tolerancia del injerto tales como la inyección de CD tolerogénicas. En humanos, existen varias posibles fuentes de aloantígenos incluyendo los exosomas, que se pueden aislar de diferentes fluidos biológicos. El objetivo de esta tesis es investigar el potencial uso de los exosomas derivados de plasma como fuente de aloantígenos, la capacidad de las células dendríticas humanas de sangre periférica para capturar exosomas alogénicos y, finalmente, evaluar el efecto de las CD tolerogénicas en la supervivencia del injerto en un modelo de trasplante renal alogénico en rata. Nuestros resultados proporcionan información valiosa sobre las microvesículas derivadas del plasma. Mediante análisis proteómico hemos detectado 161 proteínas asociadas a las microvesículas, incluyendo muchas relacionadas con el complemento y con las cascadas de transducción de señales de la coagulación. Sin embargo, cuando las preparaciones enriquecidas en exosomas fueron analizadas el número de proteínas identificado fue muy reducido, lo que sugiere que en condiciones saludables hay cantidades limitadas de exosomas y, por tanto, no son una fuente viable de aloantígenos. Por otra parte, nuestros resultados proporcionan nueva información sobre la interacción de las células dendríticas humanas de sangre periférica con los exosomas alogénicos. Los experimentos in vitro muestran que tanto las CD convencionales como las plasmacitoides capturan exosomas derivados de una línea de células T aunque con diferente capacidad. La captura de los exosomas por las CD plasmacitoides no modifica su estado de activación. Además, las CD plasmacitoides cargadas con los exosomas son capaces de estimular linfocitos T autólogos lo que sugiere que esta población podría tener un papel en la presentación de aloantígenos. Por último, hemos generado CD tolerogénicas en presencia de dexametasona con el fin de evaluar su efecto en un modelo de trasplante renal en rata. Los aloantígenos donantes fueron obtenidos a partir de exosomas derivados de células dendríticas inmaduras derivadas de médula ósea. Tras la captura de los exosomas donantes, las CD presentan un fenotipo semi-maduro y un perfil de citocinas anti-inflamatorio. Aunque estas DC tolerogénicas no mejoran la supervivencia del aloinjerto tras su inyección vía intravenosa en las ratas receptoras del riñón, son capaces de modificar el número de células B en sangre periférica. Además, los experimentos in vitro muestran que las CD tolerogénicas son capaces de inhibir la proliferación dependiente de LPS de las células B. Estos resultados indican que las CD tolerogénicas, cargadas o no con exosomas donantes in vitro, pueden tener un papel biológico en el rechazo del trasplante a través de la modulación de la respuesta de células B.

Following transplantation, the immune system is triggered to induce an immune response to donor histocompatibility antigens expressed by the graft (allo-antigens), leading to organ rejection. Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells and have a fundamental role in the initiation of the immune response to the graft by presenting allo-antigens to T cells through several pathways. However, DCs are also key players in the induction of tolerance. One of the main targets in transplantation is the induction of donor-specific tolerance thereby avoiding chronic administration of immunosuppression, which has many side effects. Understanding the immunological mechanisms involved in transplant rejection has allowed the generation of alternative therapies to conventional immunosuppression. In different animal models, several strategies have been employed to induce graft tolerance such as the injection of tolerogenic DCs. In humans, there are several possible sources of alloantigens including exosomes, which can be isolated from several biological fluids. The aim of this thesis is to investigate the potential use of plasma-derived exosomes as a source of alloantigens, the ability of human peripheral blood dendritic cells to capture allogeneic exosomes and finally, evaluate the effect of recipient tolerogenic DCs on allograft survival in a model of allogeneic kidney transplantation in rats. Our results provide valuable information about plasma-derived microvesicles. By proteomic analysis, we have detected 161 microvesicle-associated proteins, including many related to the complement and coagulation signal-transduction cascades. However, when exosomes-enriched preparations were analysed the number of proteins identified was much reduced, suggesting that under healthy conditions there are limited amounts of exosomes and, therefore, are not a feasible source of alloantigens. Moreover, our results provide some insight in the interaction of human peripheral blood DCs subsets with allogeneic exosomes. In vitro analyses show that both conventional DCs (cDCs) and plasmacytoid DCs (pDCs) capture exosomes from a T-cell line, although with different ability. The uptake of exosomes does not modify the activation state of pDCs. In addition, exosomes-loaded pDCs are able to stimulate autologous T cells suggesting that this subset could have a role in allo-antigen presentation. Finally, we have generated tolerogenic DCs in the presence of dexamethasone to evaluate their effect in a model of kidney transplantation in rats. Donor alloantigens were obtained from immature BMDCs-derived exosomes. After donor exosomes capture, tolerogenic DCs present a semi-mature phenotype and an anti-inflammatory cytokine profile. Although these tolerogenic DCs do not improve allograft survival, after intravenous injection in kidney recipients are able to modify the number of peripheral blood B cells. In addition, in vitro experiments show that tolerogenic DCs are able to inhibit LPS-dependent proliferation of B cells. These results indicate that tolerogenic DCs, in vitro loaded or not with donor exosomes, may have a biological role in transplant rejection through the modulation of B cell responses.