Novel methods and tools for corneal barrier function assessment through non-invasive impedance measurements

Abstract

La còrnia és una estructura transparent ubicada a la part frontal de l’ull que permet la transmissió de la llum i protegeix globus ocular d’agressions externes. La principal característica de la còrnia és la seva transparència. Aquesta depèn del nivell de hidratació de l’estroma, que ha de mantenir-se en un constant estat de deshidratació. Aquest nivell de hidratació depèn d’un equilibri dinàmic entre els fluxos iònics que travessen les capes endotelials i epitelials. Per tant, la permeabilitat d’aquestes capes resulta un factor determinant per mantenir la homeòstasis corneal i conseqüentment, la transparència corneal. Malgrat això, no existeixen mètodes apropiats per avaluar la funció barrera corneal de forma no invasiva i que puguin ser utilitzats in vivo. Ja que la permeabilitat iònica té molta importància en les propietats elèctriques passives dels teixits vius, els mètodes basats en aquestes propietats són àmpliament utilitzats en estudis in vitro de la funcionalitat de les capes corneals. Aquesta tesis doctoral es centra en el desenvolupament i validació d’un mètode no invasiu per l’avaluació de l’estat funcional de les principals capes corneals que pugui ser utilitzat in vivo. Per avaluar la viabilitat del mètode proposat s’ha desenvolupat un model numèric basat en elements finits (FEM). Els resultats de les simulacions indiquen que les mesures obtingudes mitjançant elèctrodes col·locats sobre la superfície corneal són suficientment sensibles als canvis de les propietats elèctriques de l’endoteli i de l’epiteli. Una primera versió del sensor d’impedància s’ha fabricat utilitzant un substrat de Pyrex®. De forma que s’ha d’aplicar una certa pressió per tal d’aplanar la curvatura corneal i assegurar el contacte elèctric entre la superfície corneal i els elèctrodes. Malgrat la pressió exercida, sols es pot assegurar el contacte elèctric per la configuració d’elèctrodes més pròxima. Malgrat aquesta limitació, s’ha validat la capacitat del mètode per avaluar in vivo la funció barrera de la còrnia. Per tal de superar les limitacions del substrat rígid, s’ha desenvolupat un sensor de impedància flexible basat en un substrat polimèric de SU-8. D’aquesta forma, la facilitat d’ús i aplicabilitat del mètode proposat milloren notablement ja que no es requereix pressió per aplicar el sensor. La viabilitat del mètode ha estat avaluada incrementant farmacològicament la permeabilitat epitelial de conills i monitoritzant el procés de cicatrització de l’epiteli. Els resultats obtinguts s’han comparat satisfactòriament amb mesures de permeabilitat a la fluoresceïna, un mètode destructiu que es relaciona directament amb la permeabilitat. També s’ha observat que la resolució de les mesures realitzades està principalment limitada per variacions en el gruix de la llàgrima entre el sensor i la superfície corneal. De la mateixa forma, s’ha observat que la contribució de la llàgrima a la impedància mesurada es pot minimitzar augmentant la separació. En paral·lel amb el desenvolupament del sistema in vivo, s’ha estudiat la possibilitat d’aplicar el mètode a l’avaluació de la funció barrera de l’endoteli en còrnies extretes. Aquest nou desenvolupament podria ser molt útil per avaluar la funcionalitat corneal abans d’un transplantament. El mètode proposat permetrà la simplificació dels procediments experimentals utilitzats actualment, que requereixen de l’eliminació de l’epiteli abans de fer la mesura. Les mesures d’impedància obtingudes s’han comparat satisfactòriament amb tècniques microscòpiques de tinció immunològiques. El treball multidisciplinar presentat en aquesta tesis doctoral ha resultat en un nou mètode per a l’avaluació in vivo de la funció barrera corneal de forma no invasiva. Els excel·lents resultats obtingut han permès la transferència tecnològica del mètode proposat a la pràctica clínica. D’aquesta forma, el microsistema desenvolupat ha estat acceptat com a dispositiu mèdic per l’Agència Espanyola dels Medicaments i Productes Sanitaris (AEMPS) per ser utilitzat en humans. Actualment, el mètode desenvolupat es troba en fase d’assaig clínic.

The cornea is a hemispherical transparent structure located in front of the eye that allows the transmission of light and protects the ocular globe against external aggressions. The corneal transparency depends on the hydration of the stroma, which has to remain in a constant state of dehydration. This hydration level depends on a dynamic equilibrium between the ion fluxes through the endothelial and epithelial layer. Thus, the permeability of those layers plays the most important role to maintain the corneal homeostasis, and finally, the corneal transparency. However, there is a lack of proper non-invasive methods for assessing the corneal barrier function in in vivo conditions. Since ionic permeability has a fundamental impact on the passive electrical properties of living tissues, methods based on the study of those properties have consistently been used in in vitro studies of the corneal layers functionality. This dissertation is focused on the development and validation of a non-invasive method to assess the functional state of the main corneal layers in in vivo conditions. An electrical model of the cornea has been developed and analyzed by means of finite elements method (FEM). The simulation results indicate that the measurements performed by electrodes placed on the corneal surface are indeed sufficiently sensitive to the changes in the electrical properties of the epithelial and endothelial layers. The impedance sensor was firstly fabricated using a rigid Pyrex substrate. Consequently, in order to flatten the corneal curvature and ensure the electric contact between the electrodes and the corneal surface a reasonable pressure must be applied. However, the proper electric contact can only be achieved with the closest electrode configuration. Despite this limitation, the capability to in vivo assess the corneal barrier function was successfully evaluated. To overcome the limitations of the rigid substrate, a flexible impedance sensor has been developed using a polymeric SU-8 substrate. Therefore, the usability and performance of the proposed method is increased since no pressure is needed to place the sensor on the corneal surface. Its feasibility was evaluated in vivo by pharmacologically increasing the epithelial permeability and monitoring a corneal epithelium wound-healing process. The obtained impedance results were successfully compared to the measurements of permeability to sodium fluorescein, a well-known destructive method directly related with the permeability. It was also observed that the resolution of the performed measurements is mainly limited by variations in the tear film thickness between the sensor and the corneal surface. However, it was observed that the contribution of the tear film to the measured impedance can be minimized by increasing the separation between electrodes. In parallel with the development of the in vivo system, it has been studied the possibility to apply the method to assess the endothelium barrier function of excised corneas. This new development could be a helpful tool for evaluating the corneal functionality before grafting. The proposed method will allow the simplification of the currently used experimental procedures, which requires the remove of the epithelium to perform the measurement. The obtained impedance results were successfully compared with microscopy immunostaining techniques. The multidisciplinary work described in this dissertation has given rise to a novel method for in vivo assessment of the corneal barrier function in a non-invasive way. The excellent results obtained in the experimental field have allowed transferring the proposed method to the clinical practice. Thus, the developed microsystem has been accepted as a medical device by Spanish Agency of Medicines and Medical Devices(AEMPS)to be used in humans. Currently, the developed method is clinical assay phase.