Estudio de la implicación de los genes Rv1686c-Rv1687c y Rv3161c de Mycobacterium tuberculosis en la resistencia a fármacos

Abstract

La tuberculosis es considerada como una de las enfermedades infecciosas más importantes del mundo. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud un tercio de la población mundial ha estado expuesta al agente causal Mycobacterium tuberculosis, que causa cerca de dos millones de muertes al año. La complejidad y duración del tratamiento, así como la aparición de cepas resistentes, exigen mejorar el conocimiento de los mecanismos de resistencia así como desarrollar nuevos fármacos o inhibidores que sean más eficaces. La resistencia de M. tuberculosis a antimicrobianos es debida a varios mecanismos operan en muchos casos simultáneamente. Entre ellos están las mutaciones en genes diana, la producción de enzimas que modifican o inactivan fármacos, la baja permeabilidad de la pared celular y las bombas de eflujo. Muchos de estos mecanismos de detoxificación son inducidos por diferentes compuestos incluidos los fármacos utilizados para el tratamiento. Estudios previos mostraron que el triclosán, un biocida con alta actividad antimicrobiana, induce en M. tuberculosis dos posibles sistemas de detoxificación: una posible dioxigenasa codificada por Rv3161c y un posible transportador tipo ABC codificado por Rv1686c-Rv1687c, sugiriendo que estos sistemas podrían tener un papel en el bajo efecto del triclosán en M. tuberculosis. También, se ha observado que el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c se induce en macrófagos activados, en respuesta al H2O2 y a la privación de nutrientes sugiriendo que podría tener un papel en la virulencia de la bacteria. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el papel de estos sistemas en la resistencia al triclosán y otros compuestos así como en la virulencia de M. tuberculosis. Para ello se estudió el efecto del triclosán a nivel transcripcional en la cepa H37Rv en donde se detectaron altos niveles de expresión de los genes Rv1687c y Rv3161c, confirmando que estos sistemas se inducen en presencia del biocida tal y como había sido reportado en la literatura. Posteriormente, se obtuvieron mutantes deficientes y cepas sobreproductoras de ambos sistemas que se usaron para evaluar la CMI del triclosán y otros fármacos. Sin embargo, contrario a lo que se esperaba, no se observaron diferencias en las CMIs de estas cepas y las de los controles. Así mismo, se estudió el papel de estas proteínas en la virulencia, infectando macrófagos murinos con cepas deficientes y sobreproductoras de ambos sistemas. Los resultados no mostraron ningún efecto en la virulencia ni en la proliferación del bacilo en el interior de los macrófagos. A continuación se estudiaron otros factores que podrían estar implicados en la resistencia intrínseca de M. tuberculosis al triclosán. Así se comprobó que la impermeabilidad de la envuelta celular estaría en parte implicada en la resistencia al biocida. También se estudió el papel de las bombas de eflujo utilizando inhibidores de las mismas. Los resultados no mostraron evidencia de la participación de bombas de eflujo en la resistencia al biocida. Finalmente se analizó el efecto del triclosán a nivel proteómico detectándose un aumento en la abundancia de la proteína codificada por Rv3161c y una disminución de las proteínas ThiC y PepQ. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que aunque la dioxigenasa Rv3161c y el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c se inducen en presencia del triclosán, no están implicados en la resistencia de M. tuberculosis a este biocida ni a otros fármacos ensayados en este trabajo. La inducción de estos sistemas podría estar relacionada con algún mecanismo de detoxificación de metabolitos generados en respuesta al daño celular provocado por el triclosán.

Tuberculosis remains one of the most widespread infectious diseases in the world. According to the World Health Organisation, a third of the world’s population has been exposed to Mycobacterium tuberculosis, the causative agent, which causes around two million deaths a year. The complexity and duration of the treatment, as well as the emergence of drug-resistant strains, require a better knowledge of the drug-resistance mechanisms and the development of new drugs or inhibitors that are more effective. The resistance of M. tuberculosis to antimicrobials is due to multiple mechanisms operating simultaneously in many cases. These include mutations in the target genes, production of enzymes that modify or inactivate drugs, low cell-wall permeability and efflux pumps. Many of these detoxification mechanisms are induced by different compounds, including the drugs used in treatment. Previous studies have shown that triclosan, a biocide with high antimicrobial activity, induces two possible detoxification systems in M. tuberculosis: a dioxygenase encoded by Rv3161c and an ABC transporter encoded by Rv1686c-Rv1687c, suggesting that these systems could play a role in the limited effect of triclosan on M. tuberculosis. It has also been observed that the ABC transporter Rv1686c-Rv1687c is induced in response to H2O2 and to the lack of nutrients, suggesting that this could play a role in the virulence of the bacteria. In this context, the objective of this work was to assess the role of these systems in the resistance to triclosan and other compounds as well as in the virulence of M. tuberculosis. To do this, the effect of triclosan on transcriptional activity was assessed in the strain H37Rv in which high levels of expression of the genes Rv1687c and Rv3161c were detected, confirming that these systems are induced in the presence of the biocide, as had been reported in the literature. Then, deficient mutants and overproducing strains of both systems were used to assess the MIC of triclosan and other drugs. However, contrary to what was expected, no differences were observed in the MICs between these strains and the control. The role of these proteins in the virulence was also studied by infecting murine macrophages with deficient and overproducing strains of both systems. The results did not show an effect on either the deficiency or overproduction in the virulence and proliferation of the bacillus inside the macrophages. In order to identify the mechanisms related to the intrinsic resistance of M. tuberculosis to triclosan, the role of the cell envelope was assessed, and it was confirmed that biocide resistance may be related to its impermeable nature. The role of other possible efflux pumps was studied using inhibitors, and there was no evidence of the participation of any pump mediating in the biocide resistance. The effect of triclosan on M. tuberculosis proteome was also assessed in which an increase in the protein encoded by Rv3161c and a reduction in the proteins ThiC and PepQ were detected. The results obtained in this work suggest that although the dioxygenase Rv3161c and the ABC transporter Rv1686c-Rv1687c are induced in the presence of triclosan, they are not involved in the resistance of M. tuberculosis to this biocide or to other drugs tested in this work. The induction of these systems could be related to a detoxification mechanism of metabolites generated in response to the cell damage caused by triclosan.