Clinical Value of Massive Parallel HIV-1 Sequencing in Antiretroviral Treatment-Experienced Subjects

Abstract

Els test de resistència al antiretrovirals són utilitzats en la pràctica clínica per la personalització del tractament antiretroviral (TARV) de les persones infectades pel VIH-1. La seqüenciació poblacional (SP) és la tècnica més emprada pel genotipat del VIH-1 obtenint una bona correlació amb la resposta clínica dels pacients. No obstant, la baixa sensibilitat de la SP pel que fa a la detecció de mutacions de resistència als antiretrovirals (DRM) o soques X4-tròpiques presents en baixes prevalences pot comprometre l’eficàcia del TARV. L’aplicació de noves tècniques de seqüenciació massiva pel genotipat del VIH-1 (genotipat ultrasensible) permetria una caracterització de la població viral amb major resolució optimitzant el TARV. L’objectiu d’aquesta tesi era avaluar el valor clínic del genotipat ultrasensible pel maneig clínic de pacients infectats pel VIH-1 que han estat exposats a TARV. Durant la utilització de 454 sequencing per la determinació del tropisme viral, 454 sequencing va obtenir una major concordança amb ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en l’anàlisi de l’ARN viral. Tot i que la SP tenia una menor sensibilitat respecte 454 sequencing, la seva elevada especificitat li va permetre obtenir una millor precisió. Anàlisis filogenètics a partir de dades obtingudes per 454 sequencing van revelar que, encara que les determinacions eren equivalents entre amdós compartiments, en alguns pacients es va observar compartimentalització de seqüències pel que fa als haplotips i a la seva prevalença. Aquesta compartimentalització podria comprometre la determinació del tropisme viral en funció del compartiment que s’analitzi. Durant aquest treball també es va fer la validació de la SP per determinacions del tropisme a partir d’ADN proviral en un assaig clínic prospectiu i aleatoritzat. Aquest assaig va demostrar ser útil per guiar canvis de tractament antiretroviral que incloguin antagonistes de CCR5. De tota manera, 454 sequencing va ser capaç de detectar variants X4 tròpiques en dos pacients prèviament classificats com a R5 tròpics per SP. Pel que fa a la detecció de DRM en el gen pol, 454 sequencing va demostrar ser no-inferior a la SP durant l’avaluació de la susceptibilitat al tractament antiretroviral. Cal destacar que 454 sequencing va aportar informació genotípica addicional en la majoria dels pacients, encara que aquesta modifiqués poques prediccions de susceptibilitat. A més, aquesta tecnologia va ser utilitzada per explorar l’origen de les DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, demostrant que virus mutants detectats durant el fracàs virològic poden ésser originats a partir de virus mutants minoritaris preexistents. En resum, aquesta tesi ha mostrat la utilitat clínica del genotipat ultrasensible del VIH-1 en pacients experimentats al TARV. 454 sequencing ha permès una profunda caracterització de la diversitat viral dins l’hoste, facilitant l’estudi l’evolució viral i la seva patogènesi del VIH-1. A més, l’estandarització i automatització dels protocols de 454 sequencing permetria la implementació d’aquesta tecnologia pel diagnòstic del VIH-1.

Los ensayos de resistencia a los antiretrovirales son utilizados en la práctica clínica para la personalización del tratamiento antirretroviral (TARV) de las personas infectadas por el VIH-1. La secuenciación poblacional (SP) es la técnica más utilizada para el genotipado del VIH-1 obteniendo una buena correlación con la respuesta clínica de los pacientes. Asimismo, la baja sensibilidad de la SP para la detección de mutaciones de resistencia a los antiretrovirales o variantes X4-trópicas presentes en baja prevalencia puede comprometer la eficacia de la TARV. El objetivo de esta tesis era evaluar el valor clínico del genotipado ultrasensible para el manejo clínico de pacientes infectados por el VIH-1 que han estado expuestos a TARV. Durante la utilización de 454 sequencing para la determinación del tropismo viral, 454 sequencing obtuvo una mayor concordancia con ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en el análisis del ARN viral. Aunque la SP mostró una menor sensibilidad que 454 sequencing, su elevada especificidad le permitió obtener una mayor precisión. La información genotípica generada por 454 sequencing fue utilizada para evaluar la compartimentalización. Aunque las determinaciones del tropismo viral eran equivalentes entre los compartimentos, en algunos pacientes se observó compartimentalización de secuencias, lo que puede comprometer la determinación del tropismo viral en función del compartimento que analizado. Durante este trabajo también se hizo la validación de la SP para determinaciones del tropismo a partir de ADN proviral en un ensayo clínico prospectivo y aleatorizado. Este ensayo demostró ser útil para guiar cambios de tratamiento antirretroviral que incluyan antagonistas de CCR5. De todos modos, 454 sequencing fue capaz de detectar variantes X4 trópicas en dos pacientes previamente clasificados como R5 trópicos por SP. En cuanto a la detección de DRM en el gen pol, 454 sequencing demostró ser no inferior a la SP durante la evaluación de la susceptibilidad al tratamiento antirretroviral. Cabe mencionar que 454 sequencing aportó información genotípica adicional en la mayoría de los pacientes, aunque esta modificara pocas predicciones de susceptibilidad. Además, esta tecnología fue útil para explorar el origen de las DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, mostrando que los mutantes detectados durante el fracaso virológico pueden ser originados a partir de mutantes pre-existentes. En resumen, esta tesis ha mostrado la utilidad clínica del genotipado ultrasensible del VIH-1 en pacientes experimentados al TARV. 454 sequencing ha permitido una profunda caracterización de la diversidad viral dentro del huésped, facilitando el estudio de la evolución viral i la patogénesis del VIH-1. Además, la estandarización i automatización de los protocolos de 454 sequencing permitiría la implementación de esta tecnología para el diagnóstico clínico del VIH-1.

Drug resistance testing is utilized in the clinical routine to personalize ART of HIV-1 infected people. Population sequencing is employed for HIV-1 genotyping obtaining good correlations with clinical outcomes. However, its lack of sensitivity to detect minority DRM mutations or minor CXCR4-using viruses can compromise the efficacy of antiretroviral therapy (ART). The use of next generation sequencing technologies for ultrasensitive HIV-1 genotyping might allow deep characterization of the viral population optimizing the ART. The objective of this work was to evaluate the clinical value of ultrasensitive HIV-1 genotyping obtained by 454 sequencing for the management of ART-experienced HIV- 1 subjects in different treatment situations. During the utilization of 454 sequencing for viral tropism determinations, this technology achieved the closest diagnostic accuracy to ESTATM in plasma ARN. Although population sequencing had lower sensitivity than 454 sequencing, its highest specificity led to obtain closest accuracy to ESTA. Even though tropism determinations were equivalent between plasma and cellular compartments, phylogenetic analyses from data generated by 454 sequencing revealed sequence compartmentalization in some subjects. We also validated triplicate population HIV-1 genotyping from PBMC-associated DNA for viral tropism determinations in a prospective and randomized clinical trial. Here, genotypic tropism testing in proviral DNA demonstrated to become a suitable tool to guide treatment switches to CCR5 antagonists in aviremic individuals. In this study, 454 sequencing was capable to detect non-R5 viral strains in two subjects previously classified as harboring R5 HIV-1 strains by population sequencing. This compartmentalization might compromise viral tropism determinations depending on the compartment analyzed. Furthermore, the absence of evolution observed during prolonged periods of aviremia suggested that testing of stored plasma sample would be generally safe and informative. Regarding the detection of minority DRM in pol gene, 454 sequencing for ultrasensitive HIV-1 genotyping was technically non-inferior than population HIV-1 genotyping during the assessment of antiretroviral drug susceptibility. However, although this technology provided additional genotypic information beyond population sequencing in most of heavily pre-treated individuals tested, only few antiretroviral susceptibility predictions were modified. This technology was also useful to explore the origin of DRM in integrase gene, revealing that mutants detected at the time of virological failure can be originated from pre-existing minority drug resistance variants. In summary, this thesis has shown the clinical utility of ultrasensitive HIV-1 genotyping in ART-experienced HIV-1 infected individuals. However, further studies should extend our findings. 454 sequencing allowed a deep characterization of the HIV-1 diversity within a host helping to understand viral evolution and HIV-1 pathogenesis. Moreover, the standardization and automation of 454 sequencing protocols for HIV-1 sequencing would allow the implementation of this technology for HIV-1 diagnosis.