Evolution of the Human Immunodeficiency Virus type I Protease and Integrase: Effects on Viral Replication Capacity and Robustness

Abstract

La ràpida propagació del virus de la immunodeficiència humana tipus 1 (VIH-1) ha estat acompanyada d’una continua i extensa diversificació genètica vírica. Se sap poc sobre com la diversificació viral està influenciant la capacitat replicativa (CR) viral al llarg del temps. L’objectiu d’aquesta tesi va ser investigar l’impacte de la diversificació del VIH-1 sobre la seva CR. Es van analitzar dos enzims vírics essencials, la proteasa (PR) i la integrasa (IN) del VIH-1, responsables de la maduració del virió emergent i de la persistència de l’ADN víric a la cèl·lula hoste respectivament. A més, es va investigar la robustesa mutacional de la PR del VIH-1, comparant la tolerància a mutacions aleatòries úniques d’una PR del VIH-1 generada artificialment in vitro amb la PR salvatge. Primerament, es va comparar la variabilitat genètica de cent trenta-nou PR, quaranta gag i quaranta-set IN del VIH-1 procedents d’aïllats clínics naïve primerencs amb cinquanta PR, quaranta-una gag i quaranta-set IN del VIH-1 procedents d’aïllats naïve tardans obtinguts 15 anys després. A continuació, trenta-tres seqüències de la PR del VIH-1 van ser amplificades a partir de tres grups de virus: dos grups de mostres naïve aïllades amb 15 anys de diferència i un tercer grup de mostres resistents a inhibidors de PR (IP). Les PR amplificades van ser recombinades amb un clon infecciós HXB2 i la seva CR va ser determinada en cèl·lules MT4. La CR també va ser mesurada en aquests tres grups després d’haver aplicat una mutagènesi aleatòria in vitro mitjançant una PCR propensa a errors. No es van observar diferències significatives en les CR dels diferents virus recombinants tant dels aïllats naïve primerencs com tardans (P=0.5729), tot i que les PR dels aïllats tardans tenien una conservació de seqüència significativament inferior a la dels aïllats primerencs (P<0.0001). Els virus recombinants mutats aleatòriament dels tres grups mostraren una CR significativament inferior als virus salvatges corresponents (P<0.0001). No hi havia una diferència significativa en la reducció de la infectivitat viral entre els virus portadors de les PR naïve mutades aleatòriament i les mostres aïllades primer o després (P=0.8035). Notablement, es va observar una pèrdua significativament més gran de la CR en el grup de les PR resistents a IP (P=0.0400). Aquests resultats demostren que la diversificació de la seqüència de la PR no ha afectat la CR del VIH-1 o la robustesa de la PR i indiquen que les PR portadores de substitucions de resistència a IP són menys robustes que les PR naïve. Posteriorment, es van amplificar quaranta-set seqüències de la IN del VIH-1 a partir de dos grups de virus provinents de pacients naïve aïllats amb 15 anys de diferència. Les IN amplificades van ser recombinades amb un clon infecciós pNL4-3 i la CR va ser determinada amb cèl·lules CEM-GFP, un sistema reporter de GFP determinat per tat. Es van observar diferències significatives en la CR tant dels virus recombinants dels aïllats primerencs com dels aïllats tardans (P=0.0286), tot i que les IN dels aïllats tardans tenien una conservació de seqüència significativament inferior respecte a una seqüència ancestral de subtipus B (P<0.0001). Aquests resultats suggereixen que la diversificació genètica de la IN al llarg del temps ha influenciat en alguns casos la CR viral ex vivo. Remarcablement, es va trobar que alguns polimorfismes S17N, I72V, S119P, i D256E estaven relacionats amb una reducció de la CR viral i el seu efecte additiu podria perjudicar la funció de la IN. Finalment, es va avaluar l’evolució artificial de la PR del VIH-1. Es va demostrar que la PR salvatge del VIH-1 és tant vulnerable a l’addició de mutacions úniques aleatòries com una PR artificial del VIH-1 generada in vitro.

The rapid spread of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) has been accompanied by continuous extensive viral genetic diversification. Little is known about how virus diversification is influencing the viral replication capacity (RC) over time. The aim of this study was to investigate the impact of HIV-1 diversification on HIV-1 RC. HIV-1 protease (PR) and integrase (IN), two essential viral enzymes that are responsible for the maturation of the budding virion and the persistence of the viral DNA in the host cell, respectively, were analysed. In addition, the mutational robustness of the HIV-1 PR was also investigated by comparing the tolerance to single random amino acid mutations of an artificial in vitro-generated HIV-1 PR with the wild-type PR. First, the genetic variability of hundred and thirty nine HIV-1 PR, forty HIV-1 gag and forty-seven HIV-1 IN sequences from early HIV-1 naïve isolates was compared with fifty HIV-1 PR, forty-one gag and forty-seven IN sequences from late naïve isolates obtained 15 years apart. Then, thirty-three HIV-1 PR sequences were amplified from three groups of virus: two naïve sample groups isolated 15 years apart plus a third group of PR inhibitor-(PI) resistant samples. The amplified PRs were recombined with an HXB2 infectious clone and RC was determined in MT-4 cells. RC was also measured in these three groups after random mutagenesis in vitro using error-prone PCR. No significant RC differences were observed between recombinant viruses from either early or late naïve isolates (P=0.5729), even though the PRs from the late isolates had significantly lower sequence conservation scores compared with a subtype B ancestral sequence (P<0.0001). Randomly mutated recombinant viruses from the three groups exhibited significantly lower RC values than the corresponding wild-type viruses (P<0.0001). There was no significant difference regarding viral infectivity reduction between viruses carrying randomly mutated naïve PRs from early or recent sample isolates (P=0.8035). Interestingly, a significantly greater loss of RC was observed in the PI-resistant PR group (P=0.0400). These results demonstrate that PR sequence diversification has not affected HIV-1 RC or PR robustness and indicate that PRs carrying PI resistance substitutions are less robust than naïve PRs. The third study of this thesis analysed the effect of the IN genetic diversification in the virus RC. Forty-seven HIV-1 IN sequences were amplified from two groups of virus from naïve patients isolated 15 years apart. The amplified IN were recombined with a pNL4-3 infectious clone and RC was determined in CEM-GFP cells, a tat driven GFP reporter system. Significant RC differences were observed between recombinant viruses from either early or late naïve isolates (P=0.0286), even though the IN from the late isolates had significantly lower sequence conservation scores compared with a subtype B ancestral sequence (P<0.0001). These results suggest that the IN genetic diversification over time has influenced in some cases the ex vivo viral RC Interestingly, some IN polymorphisms S17N, I72V, S119P, and D256E were found to be linked to a reduced viral RC and their additive effect might contribute to impair the IN function. Finally, the artificial evolution of the HIV-1 PR was evaluated. These results demonstrated that wild-type natural HIV-1 PR was as vulnerable to the addition of single random amino acid mutations as an artificial in vitro-generated HIV-1 PR.