Study of the biological functions of the nonessential regulatory subunits of the protein phosphatase Glc7 in the yeast Saccharomyces cerevisiae

Abstract

L’única subunitat catalítica de PP1 en S. cereivisiae, Glc7, interacciona amb un mínim de 31 subunitats reguladores que li permeten regular tot el ventall de funcions. En aquesta tesis, hem estudiat les soques delecionades per cadascuna de les 21 subunitats reguladores no essencials de Glc7 realitzant-ne tant l’anàlisi fenotípic com transcripcional. Aquest estudi a gran escala ens ha permès determinar nous fenotips i perfils transcripcionals desconeguts, a més, ens ha permès focalitzar en dues subunitats reguladores: Ref2 i Reg1. En aquesta tesi, demostrem que Ref2, una subunitat reguladora necessària pel processament i maduració dels mRNA i/o dels snoRNAs, és necessària pel correcte funcionament de la homeòstasis iònica. Les cèl·lules delecionades per REF2 presenten un fenotip de sensibilitat a cations que és depenent de la unió de Glc7 implicant una nova funció del complex Glc7-Ref2. Ref2 forma part del complex holo-CPF (Cleavage Poly(A)denylation Factor), on la majoria de components són essencials per la supervivència cel·lular. Per aquesta raó, es van estudiar cèl·lules que contenien al·lels termo-sensibles dels components del holo-CPF a temperatures semi-restrictives ens ha permès determinar que aquest complex no està involucrat en la l’homeòstasi iònica. Malgrat aquesta funció separada entre el complex holo-CPF i Ref2, mutants en ambdós presenta sensibilitat a agents d’estrès en la integritat de la paret cel·lular. Tant la deleció de REF2 com els mutants en els components de la via de la integritat de la paret cel·lular presenten una sensibilitat additiva implicant una sinèrgia en l’adaptació a agents estressors de la paret cel·lular. Les cèl·lules ref2 presenten una aneuploïdia, implicant una duplicació en diversos cromosomes, amb una duplicació en el cromosoma XII comuna en el fons genètic BY4741. Aquesta aneuploïdia és deguda a la no unió de Glc7 en el holo-CPF. Diploides homozigots delecionats pel gen REF2 no són capaços d’esporular, possiblement per una mala segregació dels cromosomes en la meiosi, perquè aquestes cèl·lules no són defectives en els primers passos de la meiosi. L’altre fenotip estudiat en el mutant ref2 és la resposta a proteïnes mal plegades (UPR). Les cèl·lules ref2 són tolerants a tunicamicina possiblement degut a l’aneuploïdia. L’estudi evolutiu d’una soca salvatge al llarg de 120 generacions amb la presència continua de tunicamicina va demostrar que com a primer pas adaptatiu implica la duplicació del cromosoma II i; la resposta a llarg termini implica la pèrdua de la duplicació en el cromosoma II i la inducció específica de certs gens, entre ells les bombes de resistència a drogues pleiotròpiques. Reg1, la subunitat reguladora de Glc7 implicada en la regulació negativa dels gens repressor de glucosa defosforilant Snf1, presenta un fenotip de sensibilitat a agents que provoquen l’acumulació de proteïnes mal plegades, com la tunicamicina. Aquest fenotip coincideix amb l’al·lel glc7-109, que no permet la unió de les subunitats reguladores a Glc7, relacionant l’UPR i la regulació de la cinasa Ire1. Els nostres resultats indiquen que tant la hiperactivació de Snf1 com la sobreexpressió de proteïnes SNf1 constitutivament hiperactivades en el mutant reg1 inclús incrementen la seva sensibilitat a tunicamicina. Finalment, l’anàlisi dels mutants en els components de la via Snf1 ens ha permès determinar que la falta de RIM101 provoca una sensibilitat a tunicamicina, possiblement a la impossibilitat d’expressió de PMR1, una bomba d’alta afinitat necessària pel transport de Ca2+/Mn2+ al Golgi essencial per la UPR. En resum, els nostres resultats ens han permès descriure noves funcions per Ref2, incloent l’homeòstasi iònica i la regulació de la integritat de la paret cel·lular. Per l’altre costat, hem destapat una nova funció de Reg1 en la regulació a proteïnes mal plegades.

The only catalytic subunit of PP1 in S. cereivisiae, Glc7, interacts with at least 31 regulatory subunits that regulate the myriad of Glc7 functions. Among those subunits we performed in this thesis both transcriptional and phenotypic analysis of 21 yeast strains lacking one of the non-essential regulatory subunit of Glc7. With these high-throughput technologies we have determined theirs transcriptional profiles and new phenotypes which allowed us to focus on two regulatory subunits: Ref2 and Reg1. We demonstrate in this thesis that Ref2, a regulatory subunit necessary for the processing and maturation of mRNA and/or snoRNAs is also required for the proper functioning of ionic homeostasis under conditions of cation stress. Cells lacking REF2 display hypersensitivity to cation stress which is dependent on the binding to Glc7 involving a new function of the complex Glc7-Ref2. Ref2 is integrated in the holo-CPF (Cleavage Poly(A)denylation factor), where most components are essential for cell survival. For this reason, the study of cells carrying thermo-sensitive alleles of the holo-CPF components in semi-restrictive temperatures allowed us to conclude that this complex is not involved in ionic homeostasis. Despite this unrelated function between holo-CPF and Ref2, the holo-CPF mutants display sensitivity to cell wall stressors agents, as ref2 cells do. Deletions of REF2 and mutants in components of the cell wall integrity pathway have synergistic effects under cell wall stressors. Cells lacking REF2 display an aneuploidy, implying duplication of chromosomes, being the chromosome XII duplicated in all analysed cases of the BY4741 genetic background. This aneuploidy is due to the inability of Glc7 to bind to the holo-CPF. Furthermore, homozygous diploids lacking the REF2 genes are unable to sporulate, possibly due to a chromosome missegregation in meiosis, since cells are not defective in the early events of meiosis. Another phenotype studied in ref2 cells was the unfolded protein response (UPR). ref2 cells are hypertolerant to tunicamycin, possible due to its aneuploidy. The evolutionary study of a wild-type strain grown in tunicamycin for 120 generations showed, as an early adaptive step, duplication of chromosome II. Long-term adaptive step involves the loss of the chromosome duplication and the specific induction of certain genes, including those involved in the pleiotropic drug resistance phenomenon. Reg1, the Glc7 subunit involved in the negative regulation of glucose-repressible genes by dephosphorylating Snf1 kinase, displays hypersensitivity to agents that trigger the accumulation of unfolded proteins, such as tunicamycin. This phenotype is shared by the glc7-109, which prevents the binding of the regulatory subunits to Glc7, linking the UPR to a possible regulation of the Ire1 kinase. Our results indicate that hyperactivation of Snf1 or overexpression of constitutively activated Snf1 in reg1 mutant cells even increases the sensitivity to tunicamycin. Finally, the analysis of mutants of the components of the Snf1 pathway allowed us to conclude that the lack of RIM101 causes sensitivity to tunicamycin, possibly due to the impossibility of expressing PMR1, a high affinity Ca2+/Mn2+ P-type ATPase required for Ca2+ and Mn2+ transport into Golgi and essential for UPR. In summary, results of this thesis allow us to describe new functions for Ref2, including the ionic homeostasis and regulation of the cell wall integrity. On the other hand, we have uncovered that Reg1 is required for the correct response to unfolded proteins.