Immunoanalytical strategies based on magnetic carriers for food safety

Abstract

Los alérgenos y contaminantes alimentarios representan uno de los problemas de salud pública más extendidos del mundo. El monitoreo de posibles contaminantes resulta importante para la protección del consumidor así como también para controlar el cumplimiento de las regulaciones internacionales de etiquetado. La seguridad alimentaria sólo puede ser asegurada a través de la implementación de sistemas de control de calidad a lo largo de toda la cadena de producción desde la materia prima hasta el consumidor final. En este contexto, la disponibilidad de métodos rápidos, confiables y altamente sensibles resulta imperativo para su utilización como alarma en la detección de contaminantes, permitiendo una respuesta inmediata. Actualmente se dirigen grandes esfuerzos al desarrollo de metodologías simples, selectivas y económicas para la detección in situ de diferentes analitos en matrices complejas. En esta tesis se han desarrollado y evaluado nuevas estrategias inmunoanalíticas para la seguridad alimentaria, basadas en la integración de micro y nanopartículas así como bionanopartículas modificadas. Dos analitos de diferentes tamaños y características fueron estudiados como modelo: por un lado la gliadina, como alérgeno proteico, y por otro, la Salmonella, como ejemplo de patógeno alimentario. Se evaluaron diferentes formatos de inmunoensayo (competitivo y sándwich, directo e indirecto), aprovechando las ventajas del uso de partículas magnéticas como soporte sólido. Los resultados obtenidos fueron evaluados tanto por detección óptica como electroquímica, utilizando magneto inmunoensayos o inmunosensores, respectivamente. En todos los casos, las señales fueron obtenidas mediante conjugados con la enzima peroxidasa como marcadores ópticos o electroquímicos, analizando tanto el desempeño analítico como el efecto matriz a través de muestras alimentarias dopadas. En el caso de la integración de partículas magnéticas para la detección de gliadina, se desarrolló una estrategia competitiva que permitiera tanto la detección de la proteína nativa como también de fragmentos hidrolizados durante la producción de alimentos. Se obtuvieron excelentes límites de detección (del orden de μg L-1), muy por debajo de los 20 mg kg-1 establecidos por las regulaciones europeas para alimentos libres de gluten. Adicionalmente se lograron excelentes valores de recuperación al analizar muestras alimentarias dopadas como leche y cerveza libre de gluten. También se evaluó por otro lado, la integración en los inmunoensayos de bionanomateriales como los bacteriófagos, utilizando el P22 como modelo para la detección de Salmonella. Se diseñaron bionanopartículas híbridas a través de i) la inmovilización de bacteriófagos sobre micro y nanopartículas magnéticas, y ii) la modificación de la cápside con marcas de biotina. Los fagos altamente biotinilados obtenidos fueron empleados tanto para la marcación de bacterias, al unirse con marcadores fluorescentes, ópticos o electroquímicos conjugados a estreptavidina, así como para la captura al ser acoplados a partículas magnéticas modificadas con estreptavidina. Las bionanopartículas fueron caracterizadas mediante numerosas técnicas, como métodos de cultivo microbiológico, electroforesis, microscopía confocal de fluorescencia, así como microscopías electrónicas de barrido y transmisión. En todos los casos, se desarrollaron estrategias no competitivas integrando los fagos como marca o elemento bioreconocimiento. Se logró una considerable reducción del tiempo de detección de 3 a 5 días necesarios en las técnicas microbiológicas clásicas, a tan sólo 2-4 hs. Adicionalmente, se alcanzaron límites de detección excepcionales, lográndose detectar por debajo de 102 CFU mL-1 de Salmonella en muestras de leche, y tan sólo 1 CFU en 25 mL luego de 6 hs de preenriquecimiento. Por último, cabe destacar que en todos los casos se obtuvo mejor sensibilidad y menor efecto matriz utilizando detección electroquímica. En consecuencia, los biosensores desarrollados resultan en una herramienta prometedora para aplicaciones dentro del campo alimentario debido a su capacidad de detección rápida e in situ, así como también la facilidad de miniaturización y compatibilidad para producción en masa.

Food allergens and food contaminants represent an important health problem worldwide. Tracking and tracing of hazard-free food production chains has become important due to consumer-safety concerns and to fulfill international labeling regulations. Food safety can only be ensured through the enforcement of quality-control systems throughout the entire food chain from the incoming raw materials until the final consumer. In this context, the availability of rapid, reliable and highly sensitive methods is mandatory for their use as an “alarm” to rapidly detect potential contaminants and take an immediate action. Therefore, great efforts are directed towards the development of simple, selective and cost-efficient methodologies for the on-site detection of different target analytes in complex food samples. This dissertation addresses a comprehensive study and assessment of novel and rapid immunoanalytical strategies in different formats by the integration of micro and nanoparticles as well as hybrid bionanoparticles for food safety. Two analytes of different sizes and characteristics (single and multivalence targets) affecting food safety, were selected as a model: the small proteic allergen gliadin and the food-borne pathogen Salmonella. Different immunoassay formats were assessed (competitive and sandwich, direct and indirect) taking advantage of the outstanding features of magnetic micro and nanoparticles as solid support. The results obtained with the novel strategies were evaluated by a dual detection through optical and electrochemical readouts, using magneto immunoassays or magneto immunosensing approaches, respectively. In all cases the signals were obtained by a horseradish peroxidase (HRP) conjugate as the enzymatic optical and electrochemical reporter and the matrix effect and analytical performance were evaluated using spiked food samples. Regarding the integration of magnetic particles in the detection of food allergens such as gliadin, a competitive approach was developed to detect not only the native protein, but also the small gliadin fragments, being thus valid for both non-treated and hydrolyzed foodstuff. Excellent detection limits (in the order of μg L-1) were achieved, much lower than the EC recommendation of 20 mg kg-1 for glutenfree food. Furthermore the matrix effect, as well as the performance of the assays was successfully evaluated using spiked gluten-free foodstuffs, such as skimmed milk and gluten-free beer, obtaining excellent recovery values. The integration of bionanomaterials as bacteriophages into the immunoassays was also explored, using P22 bacteriophage as a model to detect Salmonella. Hybrid bionanoparticles were designed and evaluated by i) immobilizing the bacteriophages on magnetic micro and nanoparticles and ii) modifying the phage capsid proteins with biotin tags. The highly biotinylated bacteriophages were applied for bacterial tagging when coupled to fluorescent, optical or electrochemical streptavidin-conjugated reporters, as well as for bacteria capturing when attached to streptavidin-modified magnetic particles. The novel hybrid bionanoparticles were extensively characterized through a wide range of techniques, such as microbiological culturing methods, electrophoresis, confocal fluorescence microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. In all cases, non-competitive approaches were developed by integrating the bacteriophages both for the biorecognition and tagging of Salmonella Thyphimurium. All the strategies were able to considerably reduce the time of the bacteria detection from the 3-5 days required in the conventional microbiology techniques, to as low as 2-4 h. In addition, outstanding limits of detection were achieved, being able to detect below 102 CFU mL-1 of Salmonella in milk samples, and as low as 1 CFU in 25 mL after 6 h pre-enrichment. Finally, it should be pointed out that better sensitivity and lower matrix effect were achieved with the electrochemical detection. As a result, the developed biosensing devices are promising tools for food safety applications due to their rapid and on-site testing capability as well as the compatibility with miniaturization and mass fabrication technologies.