Regulació del creixement axonal per Presenilina-1/γ-secretasa: paper del receptor EphA3

Abstract

Resum Mutacions en els gens de les presenilines (PS: PS1 i PS2), el component catalític del complex γ-secretasa, són la principal causa d'Alzheimer familiar hereditari (FAD). Evidències recents demostren que mutacions associades a FAD produeixen una reducció del processament per PS/γ-secretasa de diversos substrats, suggerint un mecanisme de pèrdua de funció d´aquestes mutacions. De fet, la inactivació genètica d'ambdues PS en el cervell adult causa dèficits en la plasticitat sinàptica i memòria, i neurodegeneració. Durant el desenvolupament embrionari, la inactivació de PS1 indueix canvis en la neurogènesi i la mort prematura probablement degut, almenys en part, a alteracions en la via de senyalització de Notch. Malgrat això, el paper de la PS1 i/o l´activitat γ-secretasa i els mecanismes moleculars regulats per aquests durant els processos de diferenciació neuronal, tals com el creixement axonal i dendritic i la formació de sinapsis, en gran part es desconeixen. Un dels principals esdeveniments durant la maduració neuronal és el creixement de l´axò, un procés necessari per establir connexions sinàptiques adequades pel funcionament dels circuits neuronals. La família de proteïnes Rho GTPases regulen la polarització neuronal i el creixement de l'axó. Per altra banda, els receptors tirosina quinasa d´efrina (Eph) regulen el creixement i la guia axonal durant la maduració neuronal. L'activació dels receptors Eph indueix el col·lapse del con de creixement i la retracció axonal a través de l'activitat RhoA. L´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha sigut investigar el paper de PS1/γ-secretasa durant el creixement axonal, així com els mecanismes moleculars implicats en aquesta regulació. Els resultats obtinguts demostren que la inactivació genètica de PS1 en ratolins indueix una reducció del creixement axonal en la regió ventricular i en l'hipocamp. En el mateix sentit, la inactivació genètica o farmacològica de l'activitat PS1/γ-secretasa indueix una reducció significativa del creixement axonal en neurones hipocampals en cultiu. De fet, la inactivació de PS/γ-secretasa incrementa l'activitat de RhoA GTPasa causant defectes en l'elongació de l'axó, un efecte que és revertit a l´inhibir RhoA o la seva proteïna efectora ROCK. A més, en aquest treball descrivim per primera vegada que PS1 col·localitza amb el receptor EphA3 en els axons de neurones hipocampals, i que PS1/γ-secretasa regula el processament d´EphA3 de forma constitutiva i independent de lligand, essent aquest processament necessari per al creixement axonal. A més, demostrem que la generació del fragment intracel·lular EphA3 ICD per PS/γ-secretasa, és clau per al creixement axonal, de manera que un mutant de EphA3 que perd la capacitat de ser proteolitzat no reverteix els defectes del creixement axonal causats per la inactivació de PS1. Per contra, l'expressió d'EphA3 ICD rescata el creixement axonal en neurones hipocampals deficients en PS/γ-secretasa o EphA3. A més, l'expressió d'EphA3 ICD disminueix l'activitat RhoA GTPasa, a la vegada que interacciona amb les miosines Ib i IIa, proteïnes que són clau en la regulació de l´organització del citoesquelet axonal en el con de creixement. Per tant, els nostres resultats demostren que la PS1/γ-secretasa juga un paper essencial durant creixement axonal en neurones hipocampals a través de la regulació de les vies de senyalització d´EphA3 i RhoA.

Mutations in the Presenilin genes (PS: PS1 and PS2), the catalytic component of the γ-secretase complex, are the main cause of familial Alzheimer’s disease (FAD). Recent evidences show that FAD-linked mutations induce a reduction of PS/γ-secretase processing of several substrates, suggesting a loss-of-function mechanism in this mutations. In fact, the genetic inactivation of both PS in adult brain induces synaptic plasticity and memory deficits, and neurodegeneration. In developmental stages, inactivation of PS1 induces alterations in neurogenesis and premature death of the embryos, partially, due to alterations in the Notch signaling pathway. However, the role of PS1 or the γ-secretase activity and the molecular mechanisms regulated during the neuronal differentiation, such as axonal and dendritic elongation and synapse formation, are widely unknown. Axon elongation, a process necessary for the establishment of functional synaptic connections in the neural circuitry, is one of the main events during neuronal differentiation. Rho GTPase family proteins regulate neuronal polarization and axon elongation. On the other hand, ephrin tyrosine kinase receptors (Eph) regulate the elongation and axon growth during neuronal differentiation. Activation of Eph receptors induces the growth cone collapse and axonal retraction through the RhoA activity. The objective in this doctoral thesis has been to investigate the role of PS1/γ-secretase during the axonal elongation, and the molecular mechanisms involved in this pathway. Our results show that genetic inactivation of PS1 in mice induces a significant reductions of the axon growth in primary hippocampal neurons. In fact, the inhibition of PS/γ-secretase induces an increase in RhoA GTPase activity, which in turn causes elongation defects in the axon, an effect reverted by RhoA or ROCK effector protein inhibition. Moreover, in this thesis we describe for the first time the colocalization of PS1 and EphA3 receptor in the axons of hippocampal neurons, where PS1/γ-secretase regulates the constitutive and ligand-independent processing of EphA3, a mechanism necessary for axonal growth. Furthermore, we demonstrate that generation of the intracellular fragment of EphA3 (EphA3 ICD) is a key event for axonal growth, where processing-defective EphA3 mutants are not able to rescue axonal growth defects caused by PS1 inactivation. Otherwise, expression of EphA3 ICD induces a decrease of RhoA GTPase activity, which in turn interacts with myosin-IB and myosin-IIA key proteins for the reorganization of the axon cytoskeleton in the growth cone. Therefore, our results indicate that PS1/γ-secretase has an essential role during axonal growth in hippocampal neurons by regulating EphA3 and RhoA signaling pathways.