Expanding the scope of the Ribonuclease A superfamily in the host immune defense system: Structural determinants of human RNases involved in antimicrobial host defense

Abstract

El meu projecte de doctorat s’enmarca en l’estudi de l’estructura i la funció de les ribonucleases antimicrobianes humanes. Actualment, es coneixen vuit ribonucleases humanes funcionals pertanyents a la superfamília de ribonucleases secretades per vertebrats. Cal remarcar, que alhora de la seva activitat per a hidrolitzar àcids ribonucleics, també presenten altres propietats biològiques com l’activitat antimicrobiana, que suggereixen una possible funció ancestral relacionada amb el sistema immunitari. La proteïna catiònica d’eosinòfils (ECP) és un dels components majoritaris dels grànuls secundaris dels eosinòfils. Degut al seu gran nombre d’arginines l’ECP és una proteïna molt catiònica i presenta una elevada activitat antimicrobiana vers una gran diversitat de patògens, com bacteris, helmints i protozous. En el nostre laboratori hem estudiat extensament el mecanisme antimicrobià de diverses ribonucleases. Concretament, el treball desenvolupat en aquesta tesi ha permès: i. Identificar el farmacòfor de l’ECP mitjançant eines de minimització racional de l’estructura. ii. Analitzar els canvis que es produeixen a la superfície bacteriana com a conseqüència de l’acció de l’ECP i dels seus pèptids derivats. Principalment, en detallar com aquests interaccionen amb els lipopolisacàrids de la paret bacteriana. iii. Descobrir que l’agregació amiloid de l’ECP a la superfície de les bactèries és fonamental per a la seva acció antimicrobiana i, en concret, per la seva activitat d’aglutinació. iv. Identificar factors estructurals i de seqüencia en el domini N-terminal necessaris per l’acció antimicrobiana de les ribonucleases conservats durant l’evolució. v. Caracteritzar els elements seqüencials de les ribonucleases que determinen les propietats antimicrobianes i d’aglutinació mitjançant el disseny de proteïnes híbrides entre les ribonucleases 2 i 3 (EDN i ECP respectivament). vi. Descobrir que tant l’ECP com la ribonucleasa 7 presenten activitat vers micobacteris a través d’un mecanisme similar a l’exibit enfront de bacteris gram negatius. En conclusió, els resultats obtinguts en aquesta tesi ens permeten conèixer millor com les ribonucleases contribueixen a l’eliminació de diferents patògens del nostre organisme i ens obren noves vies pel disseny de nous agents terapèutics per combatre microorganismes patògens.

My PhD project focuses on the structure-function analysis of human antimicrobial RNases, Currently eight functional members have been ascribed to the vertebrate secreted RNase superfamily. Together with their catalytic activity towards RNA substrates, other biological properties have been reported such as the antimicrobial activity of diverse members of the family, therefore suggesting that RNases could have an ancestral host-defence function. The eosinophil cationic protein (ECP) is one of the major components of the secondary granules of human eosinophils. ECP is a highly cationic arginine-rich protein, which displays a high antimicrobial activity against pathogens, such as bacteria, helminths and protozoa. In our laboratory the antimicrobial mechanism of action of several RNases has been extensively studied. In particular, this work enables us to determine: i. Identify the protein pharmacophore by rational structure minimization. ii. Explore the effects that take place at the bacterial cell wall upon protein-interaction. Concretely, highlight the crucial role of the lipopolysaccharide molecule in the mechanism of action of ECP, and their N-terminal peptides. iii. Determine that the amyloid formation at the bacterial surface is crucial for the antimicrobial activity of the protein, and in particular, due to the agglutinating activity. iv. Prove that the sequence and structural determinants of RNases are evolutionary conserved at the N-terminal domain. v. Characterize the sequence and structural determinants required for antimicrobial and agglutinating activities Through RNase rational mutagenesis of the homologous RNases 2 and 3 (EDN and ECP respectively) vi. Discover that either ECP or RNase 7 present antimycobacterial activity trough a similar mechanism as proved against Gram-negative bacteria. In conclusion, the results presented in this thesis work enable us to better understanding of how RNases contribute on the host pathogen clearance and open a new window in order to the design and develop new therapeutic agents as alternative antibiotics.