Validació de l’anàlisi citogenètica exhaustiva de tot el complement cromosòmic en cèl·lula única: Aplicació translacional al Diagnòstic Genètic Preimplantacional per factor masculí

Abstract

El Diagnòstic Genètic Preimplantacional (DGP) permet realitzar el diagnòstic d’alteracions genètiques en embrions generats in vitro de parelles portadores o afectes de malalties monogèniques, per tal de seleccionar-ne els no afectes per a la seva transferència a l’úter matern. El cribratge d’aneuploïdies o PGS (preimplantation genetic screening), en canvi, consisteix en l’anàlisi de la citogenètica dels embrions per així seleccionar embrions euploides per a la seva transferència i així incrementar les taxes d’embaràs dels cicles de fecundació in vitro. El PGS pot dur-se a terme mitjançant la tècnica de la hibridació genòmica comparada sobre metafases (mCGH), que permet l’anàlisi de la dotació de cadascun dels 22 cromosomes autosòmics i dels cromosomes sexuals. Aquesta tècnica també permet la detecció de desequilibris estructurals, ja siguin deguts a translocacions Robertsonianes o recíproques presents en els progenitors, així com de delecions o duplicacions de fragments cromosòmics, sovint detectades en pronucli masculí. El PGS es duu a terme, majoritàriament, mitjançant l’estudi citogenètic d’un sol blastòmer biopsiat de cada embrió que hagi assolit l’estadi de 6-8 cèl·lules. En aquesta tesi doctoral s’ha determinat l’efecte de l’estadi de replicació de les cèl·lules en ser analitzades mitjançant la mCGH de cèl·lula única. Aquest estudi s’ha dut a terme tant en un model de línia cel·lular de fibroblasts com en blastòmers d’embrions humans crio-preservats. Un segon objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat determinar la presència d’alteracions cromosòmiques i estructurals en embrions de parelles amb factor masculí d’infertilitat, ja sigui per reorganitzacions cromosòmiques equilibrades, un seminograma anòmal o una incidència d’aneuploïdies incrementada als espermatozoides. A les famílies candidates al DGP, se’ls ha realitzat un estudi complet del seminograma i la fragmentació del DNA espermàtic amb l’objectiu de relacionar la citogenètica dels embrions i el pronòstic reproductiu de les parelles amb el grau de fragmentació del DNA espermàtic. El coneixement d’aquests paràmetres permetrà caracteritzar adequadament les parelles sotmeses a cicles de DGP i predir-ne l’èxit reproductiu. En aquesta tesi doctoral també s’ha validat una variant d’anàlisi citogenètica molt més potent que la mateixa mCGH: els arrays de CGH d’oligonucleòtids d’Agilent. S’ha valorat la correspondència entre el diagnòstic citogenètic obtingut mitjançant les metodologies de la mCGH, els arrays de CGH d’oligonucleòtids i els arrays de CGH BACs, tecnologia àmpliament utilitzada en el DGP durant els darrers anys. La validesa dels arrays de CGH d’oligonucleòtids per a la seva aplicació a DGP s’ha demostrat en un cas de DGP per un portador equilibrat d’una translocació Robertsoniana.

Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) allows the diagnosis of genetic disorders in IVF embryos from affected couples or carriers of monogenic diseases, in order to select non-affected embryos for transfer to the maternal uterus. Preimplantation genetic screening (PGS), however, consists in the cytogenetic analysis of embryos in order to select only euploid ones for transfer and thus increase pregnancy rates in IVF cycles. PGS can be carried out with the comparative genome hybridization on metaphase spreads (mCGH) technique, which allows cytogenetic analysis of the 22 autosomal chromosomes in addition to the sex chromosomes. This technique also allows the detection of structural imbalances, either due to Robertsonian or reciprocal translocations present in the parents, as well as deletions or duplications of chromosome segments, often found in male pronucleus. PGS is mainly carried out by analysing one blastomere biopsied from each embryo that has reached the 6-8-cell stage. In this thesis, we have determined the effect of the cell stage in mCGH analysis from single cells. This study has been carried out with a model cell-line of fibroblasts and also with blastomeres from human cryopreserved embryos. A second objective of this thesis was to determine the presence of structural abnormalities in embryos from couples with male-factor infertility, either with balanced chromosomal rearrangements, abnormal seminogram or increased incidence of sperm aneuploidies. A complete seminogram and sperm DNA fragmentation analysis has been performed in all PGD couples in order to study the relationship between embryo cytogenetics, reproductive prognosis and sperm DNA fragmentation. This will allow a more accurate characterisation of couples undergoing PGD cycles, so their reproductive success can be predicted. A different methodology, much more powerful than mCGH, has also been validated in this thesis for single-cell cytogenetic analysis: oligonucleotide CGH array from Agilent. Correspondence between cytogenetic diagnoses obtained by mCGH, oligonucleotide CGH array and BAC CGH array, a widely used technology in PGD in the last years, has been analysed. The validity of oligonucleotide CGH array for its application to PGD has been demonstrated in a PGD case for a balanced carrier of a Robertsonian translocation.