Molecular analysis of the mechanisms involved in THBS4 differential geneexpression in the human brain

Abstract

Durante las últimas décadas ha crecido el interés en cuestiones como qué nos hace humanos o cómo difiere a nivel molecular el cerebro humano del de nuestros parientes más cercanos. Se han podido identificar cientos de genes con diferencias de expresión entre el ser humano y otros primates no humanos. Sin embargo, es importante estudiar más en detalle estos genes para comprobar si realmente están involucrados en las características específicas de nuestro cerebro. Las trombospondinas son glicoproteínas extracelulares multiméricas que modulan las interacciones entre células y con la matriz extracelular y que se han implicado en la sinaptogénesis. Dentro de la familia de las trombospondinas, los genes de la trombospondina-2 (THBS2) y trombospondina-4 (THBS4) se expresan, respectivamente, alrededor de 2 y 6 veces más en la corteza cerebral humana en comparación con la de chimpancés o macacos. Para conocer las causas de estas diferencias de expresión, hemos llevado a cabo un análisis comparativo y funcional de la región promotora de THBS4 en humanos y en chimpancés. Hemos identificado y validado un sitio de inicio de transcripción (TSS) alternativo para THBS4 que se encuentra 44 kb aguas arriba del TSS de referencia y que genera una nueva isoforma de ARNm que podría haber aparecido más tarde durante la evolución. Para comparar los niveles de expresión de ambos transcritos se realizó RT-PCR cuantitativa en diferentes tejidos humanos y en muestras de corteza cerebral de 11 humanos, 11 chimpancés y 8 macacos. Curiosamente, la nueva isoforma de THBS4 se expresa principalmente en los tejidos cerebrales. Por otra parte, la diferencia de expresión entre humanos y primates no humanos para la isoforma alternativa son consistentes con la encontrada al analizar la expresión total de THBS4. Por tanto, el aumento de la expresión de THBS4 en el cerebro humano parece estar relacionado con una mayor transcripción a partir del promotor alternativo. Para evaluar la actividad de ambas secuencias promotoras en humanos y en chimpancés, hemos llevado a cabo ensayos con un gen indicador en diferentes líneas celulares humanas. Se han encontrado diferencias significativas entre los dos promotores, aunque en las líneas de neuroblastoma que utilizamos no existen diferencias significativas entre especies. Este resultado es consistente con la búsqueda de sitios de unión de factores de transcripción en la región del promotor alternativo, ya que sólo se detectaron tres posibles sitios de unión diferentes entre ambas especies. Se ha comparado también la metilación del ADN en una isla CpG situada aguas arriba de la nueva isoforma de THBS4 en 5 humanos y en 5 chimpancés, detectando niveles bajos de metilación en ambas especies. Basándonos en las predicciones informáticas disponibles y en experimentos piloto de ChIP-Seq, hemos buscado posibles enhancers que estén controlando el promotor alternativo de THBS4, pero no hemos encontrado ningún candidato fiable. Por último, en humanos, se ha visto que hay dos haplotipos de THBS4 diferentes que se encuentran mantenidos mediante selección equilibradora. Sin embargo, la comparación experimental de ambos no muestra ningún efecto del genotipo sobre la expresión de THBS4. Aunque no se ha conseguido identificar la causa concreta del incremento en los niveles de THBS4 en humanos, en base a nuestros resultados sugerimos que la expresión diferencial del gen podría estar relacionada con una secuencia potenciadora específica del cerebro que no hemos conseguido localizar. Comprender como se encuentra regulada esta posible secuencia potenciadora podría ser relevante para entender cuales son las consecuencias funcionales de las diferencias de expresión de THBS4 sobre la evolución del cerebro y, en última instancia, darnos pistas sobre como nos convertimos en humanos.

The last decades have seen a growing interest in what makes us humans and how the human brain differs from that of our closest relatives at the molecular level. Hundreds of genes with expression differences between human and non-human primates have been identified. However, it is important to study these genes in more detail to see if they are really involved in human brain characteristics. Thrombospondins are multimeric extracellular glycoproteins that modulate cell-cell and extracellular matrix interactions and have been implicated in synaptogenesis. Within the thrombospondin family, thrombospondin-2 (THBS2) and thrombospondin-4 (THBS4) show, respectively, a ~2-fold and ~6-fold upregulation in human cerebral cortex compared to chimpanzees and macaques. To analyze the causes of these expression differences, we have carried out a comparative and functional analysis of the THBS4 promoter region in humans and chimpanzees. We have identified and validated an alternative transcription start site (TSS) for THBS4 that is located ~44 kb upstream from the known TSS and generates a new mRNA isoform that might have appeared later that the reference one during evolution. To compare expression levels of both mRNAs, we performed quantitative RT-PCR in different human tissues and cortical regions of 11 humans, 11 chimpanzees and 8 macaques. Interestingly, the new isoform of THBS4 is expressed mainly in brain tissues. Moreover, expression differences between human and non-human primate cortex for this alternative isoform are consistent with those shown for total THBS4 expression. Increased THBS4 expression in the human brain therefore appears to be related to higher transcription from the alternative promoter. To evaluate the activity of both THBS4 promoter sequences we performed reporter assays from humans and chimpanzees in different human cell lines. We have found significant differences between both promoters, but not between species, in the neuroblastoma cell lines assayed. This result is consistent with the search for transcription factor binding sites (TFBS) in the alternative promoter region, which only detected three putative TFBS differentially predicted between both species. We also compared the DNA methylation in a CpG island upstream the new isoform in 5 humans and 5 chimpanzees detecting similar low methylation levels in all of them. Based in the computational predictions available online and ChIP-Seq pilot experiments, we searched for a putative enhancer region controlling the THBS4 alternative promoter without finding any reliable candidate. Finally, in humans, THBS4 has been associated to two different haplotypes that are maintained by balancing selection, but experimental analysis did not show any effect of the genotype over THBS4 gene expression. Although we have not been able to identify the ultimate cause of the increased THBS4 levels in humans, based on all our results we suggest that the differential gene expression might be related to a brain-specific enhancer sequence that has so far escaped our scrutiny. Understanding its regulation could be relevant to the functional consequences of THBS4 expression differences during human brain evolution and ultimately could give us clues of how we became humans.