Mecanismos de desregulación de la metilación del DNA y de micrornas en células implicadas en la patogénesis de la artritis reumatoide

Abstract

La presente tesis doctoral se ha centrado en investigar los procesos de desregulación en la metilación del DNA y de microRNAs en dos tipos celulares implicados en la patogenia de la artritis reumatoide, cuya función se encuentra exacerbada en el sinovio de las personas afectadas: fibroblastos sinoviales y osteoclastos. En primer lugar, se han analizado los fibroblastos sinoviales obtenidos de articulaciones procedentes de pacientes con artritis reumatoide, comparando los niveles de metilación del DNA y de expresión de microRNAs entre dos series obtenidas de pacientes y controles. En segundo lugar se ha estudiado el proceso de osteoclastogénesis, por el cual los monocitos, se fusionan y diferencian en osteoclastos multinucleados, capaces de degradar el hueso. Los fibroblastos sinoviales y los osteoclastos son dos tipos celulares que en artritis reumatoide tienen una función aberrante, dado que se encuentran hiperactivos. En la articulación afectada, los fibroblastos sinoviales hiperactivos degradan el cartílago, mientras que los osteoclastos, contribuyen a la destrucción del hueso. Tras un proceso continuado de degradación, la articulación puede perder su función y la persona que padece la AR quedar seriamente afectada. En el caso de los fibroblastos sinoviales, se han extraído de rodillas de personas con artritis reumatoide, y los hemos comparado con controles examinando sus perfiles de metilación de DNA y miRNAs, para investigar las diferencias entre los fibroblastos de pacientes y controles. Las variaciones entre los dos grupos encontradas indican potenciales vías de señalización y genes desregulados en esta enfermedad. Ente los ejemplos más reseñables cabe destacar la hipometilación del gen IL6R, TNFAIP8, HOXA11y CD74. Además, los datos de metilación, expresión de microRNAs así como expresión de mRNA, se integraron para conocer en profundidad las interconexiones entre las diferentes capas de regulación que están detrás del comportamiento aberrante de este tipo celular. Por otro lado, hemos analizado in vitro qué cambios epigenéticos suceden durante la diferenciación de monocitos a osteoclastos. Para ello, hemos realizado un análisis de metilación de DNA durante el proceso de diferenciación de monocitos y osteoclastos derivados de los anteriores, así como de varias series temporales para conocer las dinámicas de metilación. Como resultado hemos descubierto que en este proceso de diferenciación, el perfil de metilación cambia drásticamente. Genes clave en la función del osteoclasto, como la CTSK, ACP5 o TM4SF7, se hipometilan de forma activa, rápidamente, y se sobreexpresan. También genes específicos de monocito, como el CX3CR1 se hipermetilan y silencian específicamente. Además, hemos determinado que el factor de transcripción PU.1, tiene un papel clave en este cambio epigenético, dado que actúa como conector dual en el reclutamiento de la maquinaria epigenética (TET2 y DNMT3b) que va a modificar, en un sentido o en otro (hipometilación e hipermetilación) el epigenoma. La caracterización del mecanismo a nivel molecular en este proceso de diferenciación es clave para posteriormente encontrar vías de señalización que potencialmente puedan ser inhibidas farmacológicamente. Por último, se ha analizado el perfil de expresión de microRNAs en este proceso de diferenciación mieloide. Se ha realizado inicialmente un screening de expresión de 380 miRNAs a varios tiempos (0d, 2d y 21d), centrándonos posteriormente en dos clusters de miRNAs, el miR-212/132 y el miR- 99b/let-7e/125a. Se ha demostrado el papel clave que estos microRNAs desempeñan en el proceso de diferenciación, dado que su inhibición funcional, retrasó la formación de los osteoclastos, así como la expresión de marcadores de osteoclasto, y la represión de genes de linaje alternativo.

ARTICLE 1: Autoimmune rheumatic diseases are complex disorders, whose etiopathology is attributed to a crosstalk between genetic predisposition and environmental factors. Both variants of autoimmune susceptibility genes and environment are involved in the generation of aberrant epigenetic profiles in a cell-specific manner, which ultimately result in dysregulation of expression. In this study we performed DNA methylation and miRNA expression screening of a set of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and compared the results with those obtained from osteoarthritis patients with a normal phenotype. DNA methylation screening allowed us to identify changes in novel key target genes like IL6R, CAPN8 and DPP4, as well as several HOX genes. A significant proportion of genes undergoing DNA methylation changes were inversely correlated with expression. miRNA screening revealed the existence of subsets of miRNAs that underwent changes in expression. Integrated analysis highlighted sets of miRNAs that are controlled by DNA methylation, and genes that are regulated by DNA methylation and are targeted by miRNAs with a potential use as clinical markers. Our study enabled the identification of novel dysregulated targets in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and generated a new workflow for the integrated analysis of miRNA and epigenetic control. ARTICLE2: Background: DNA methylation is a key epigenetic mechanism for driving and stabilizing cell-fate decisions. Local deposition and removal of DNA methylation are tightly coupled with transcription factor binding, although the relationship varies with the specific differentiation process. Results: Here we focused on DNA methylation changes during osteoclastogenesis. Hypermethylation and hypomethylation changes took place in several thousand genes, including all relevant osteoclast differentiation and function categories. Hypomethylation occurred in association with changes in 5-hydroxymethylcytosine, a proposed intermediate toward demethylation. Transcription factor binding motif analysis revealed an overrepresentation of PU.1, NF-kB and AP-1 (Jun/Fos) binding motifs in genes undergoing DNA methylation changes. Among these, only PU.1 motifs were significantly enriched in both hypermethylated and hypomethylated genes; ChIP-seq data analysis confirmed its association to both gene sets. Moreover, PU.1 interacts with both DNMT3b and TET2, suggesting its participation in driving hypermethylation and hydroxymethylation-mediated hypomethylation. Consistent with this, siRNA-mediated PU.1 knockdown in primary monocytes impaired the acquisition of DNA methylation and expression changes, and reduced the association of TET2 and DNMT3b at PU.1 targets during osteoclast differentiation. Conclusions: The work described here identifies key changes in DNA methylation during monocyte-to-osteoclast differentiation and reveals novel roles for PU.1 in this process.