Contribución al fenotipado molecular de tumores cerebrales preclínicos mediante estudios in vitro e in vivo

Abstract

Los tumores del sistema nervioso central (SNC) abarcan menos de un 2 % del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial (aproximadamente 175.000) representado entre 0,4 y 25,4 de casos por 100.000 adultos. A pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. Actualmente los conocimientos que se tienen sobre el desarrollo de los tumores es reducido, porque en la mayor parte de los casos los tumores cerebrales se detectan en estado avanzado de desarrollo (como consecuencia, principalmente, de la aparición de síntomas que llevan al paciente a indagar sobre su estado). Es por esto que se tienen pocos datos de las fases iniciales de desarrollo de estos tumores. Por tanto, es necesario esclarecer el fenotipo molecular de la progresión de tumores cerebrales in vivo, con el objeto de conocer mejor su evolución y poder así mejorar su detección, ya que cuanto más se tarde en alcanzar el diagnóstico correcto, más se reducen las posibilidades de la persona afectada de sobrevivir al tumor. El trabajo de esta tesis, se ha centrado en intentar comprender los lípidos móviles. Cuando se habla de lípidos móviles (ML, en la abreviatura clásica anglosajona) visibles por espectroscopía de RMN, se hace referencia básicamente a las resonancias provenientes de las cadenas de ácidos grasos de lípidos neutros en triacilgliceroles, apareciendo las más características a 0,9, 1,3, 2,0 y 5,3 ppm. El interés por entender el origen celular de estas resonancias proviene de su aparición en numerosas muestras biológicas, tanto asociadas con malignidad y muerte celular como con procesos benignos como diferenciación y variación de la velocidad de proliferación. Actualmente no se conoce el significado celular de los cambios vistos en espectroscopia de resonancia magnética en los lípidos móviles, aunque se cree que se trata más bien de cambios biofísicos más que bioquímicos, ya que se ha comprobado que su concentración no varía, lo que varía es la detección mediante MRS. Para obtener más información sobre el origen celular de los lípidos móviles, se trabajó con cultivos celulares de células de glioma de rata (C6) que se estudiaron con HR-MAS a diferentes velocidades para estudiar el efecto de dicha velocidad en la “visualización” de dichos lípidos móviles. Así mismo, se desarrollaron modelos in vitro de gotículas celulares y se inmovilizaron dichos modelos para ver cómo afectaba a la “visualización” de lípidos móviles. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón (¹H MRS) se presenta como una posible alternativa para la caracterización de tumores cerebrales, ya que es una técnica que permite obtener información, de forma no invasiva, de la presencia de algunos productos del metabolismo celular. Con estos datos se pretende esclarecer el fenotipo molecular de tumores cerebrales in vivo, lo que nos permitiría reconocer patrones que nos ayuden a identificar los diferentes tipos de tumores cerebrales. Siguiendo este objetivo, en esta tesis se trabajó con modelos preclínicos de ratón con glioblastoma, oligodendroglioma de grado II y III y parénquima cerebral sano y se desarrollaron cuatro clasificadores de tipo y grado tumoral nuevos para tumores cerebrales preclínicos en ratón mediante el uso del programa Spectra Classifier aplicado a matrices de datos de imagen espectroscópica (IERM).

Central nervous system tumors (CNS) represent less than 2% of all cases of cancer diagnosed each year worldwide (approximately 175,000), which means between 0.4 and 25.4 cases per 100,000 adults. Despite this, they constitute an important source of mortality and disability. Current knowledge about the etiology of these tumors is scarce, because in most cases they are detected when they are already in an advanced state, when symptoms appear. Due to this fact, there is not much information about the early stages of development of those tumors. Therefore, it is necessary research on the progression of the molecular phenotype of brain tumors in vivo, in order to better understand their evolution and improve their detection, because the time spent to achieve the correct diagnosis may reduce the survival possibilities of the person afflicted by the pathology. Work in this thesis has mostly focused on mobile lipids. Mobile lipids (ML), visible by NMR spectroscopy, are resonances from fatty acyl chains of neutral lipids in triacylglycerols, the most characteristic of them resonating at frequencies of 0.9, 1.3, 2.0 and 5.3 ppm. The interest in understanding the cellular origin of those resonances arises from their presence in many biological tissues, associated with malignancy and cell death, as well as with benign processes such as differentiation or with changes in the proliferation rate. Currently, the cellular meaning of the changes observed with magnetic resonance spectroscopy in ML remains unknown. One hypothesis is that it could be associated to biophysical rather than biochemical changes, since it is not the concentration of ML that changes, but their detectability by MRS. In order to obtain more information about the cellular origin of ML, the work of this thesis was performed on rat glioma cells (C6) and High-resolution, Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy, at different spinning rates, to evaluate how such spinning rate affects the "visualization" of ML. Also, an in vitro model of artificial liipid droplets was developed. These artificial lipid droplets were than immobilized into a solid support to see how this would perturbate their NMR "visibility". Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (¹ H MRS) in vivo, is also a feasible alternative for the preoperative characterization of brain tumors, since it is a technique that allows to obtain information, in a non-invasive way, about the presence of products of cellular metabolism. In vivo ¹ H MRS data were also used in this thesis to clarify the molecular phenotype of brain tumors in vivo, thus allowing to recognize patterns that may be of help to identify the different types of brain tumors. To reach this goal, magnetic resonance spectroscopic imaging data from preclinical mouse models with glioblastoma, grade II and III oligodendroglioma and healthy brain parenchyma were used to develop four tumor type and grade classifiers using the program Spectra Classifier.