Obtención de un fragmento de anticuerpo específico contra oligómeros de Aβ como agente inmunoterapéutico de la enfermedad de Alzheimer: demostración de su eficacia en el modelo murino 3xTg-AD y mejora de su estabilidad termodinámica

Abstract

La enfermedad de Alzheimer (AD) se ha convertido en un problema de primer orden en países desarrollados debido al coste sanitario social y humano que conlleva. La hipótesis de la cascada amiloide, la más aceptada por la comunidad científica, sitúa al péptido Aβ como el responsable directo del proceso neuropatológico, concretamente a los oligómeros de Aβ. En la actualidad, existen multiples tratamientos sintomáticos-paliativos, sin que ningúno se haya descrito como curativo. Recientemente, la inmunoterapia β-amiloide se ha revelado como una posible herramienta en el tratamiento de la AD. En contraste con los anticuerpos completos, la administración de los scFv (fragmentos variables de cadena sencilla) no produce ni meningoencefalitis ni hemorragia cerebral. El uso de moléculas tipo scFv ha conseguido resultados prometedores en estudios pre-clinicos. Se trata de proteinas quimericas en donde se han fusionado los dominios VH y VL mediante un conector flexible, manteniendo la especificidad antígenica.En la presente tesis, se abordó la expresión recombinante de scFv-h3D6, un derivado de un anticuerpo monoclonal específico para los oligómeros de Aβ (mAb-h3D6, o bapineuzumab), en un sistema bateriano (E. coli) deficiente en reductasas y en co-expresión con los carriers Trx y NusA; asi como, su purificación mediante técnicas cromatográficas. La proteína presenta un plegamiento típico de las inmunoglobulinas. Su caracterización biofísica, permitió observar que bajo tratamiento térmico la molecula muestra tendencia a la agregación, promovida por la presencia de un estado intermediario con un componente-β worm-like enriquecido. De igual forma se evidenció durante el proceso de desplegamiento inducido por urea, la acumulación de un estado intermediario metaestable compuesto por el dominio menos estable (VL) desplegado y el dominio VH plegado; sugiriendo al dominio VL como el blanco para el rediseño de la estabilidad termodinámica global de la molécula. Auxiliándose en un modelo de la estructura tridimensional, se crearon una serie de variantes proteicas con el fin de aumentar la estabilidad del dominio VL. Dicho modelo tridimensional también reveló que el dominio VL, localizado en el C-terminal de la molécula, terminaba antes de que la última cadena-β fuera completada, por lo que decidimos extender dicho extremo en base a un alineamiento de 24 secuencias de scFvs depositados en el PDB.De ellos, las tres variantes de elongación del C-terminal presentaron un incremento en la estabilidad termodinámica de hasta el 26% y una disminución en la tendencia a la agregación de unos 4ºC. Esta mejora es deseable en una molécula de interés terapéutico, ya que ha de permitir una mayor vida media in vivo.Por otro lado, se examinó el efecto in vivo del scFv-h3D6 wild-type en un modelo murino triple transgénico que desarrolla la enfermedad de Alzheimer (3xTg-AD). El tratamiento se aplicó en una única dosis intraperitoneal en ratones hembra de 5 meses de edad, correspondiente a los primeros estadios de la enfermedad. Los beneficios del potencial terapéutico del scFv-h3D6 se mostraron a los 5 días, tanto a nivel conductual, como celular y molecular; principalmente, por su capacidad de eliminar los oligómeros de Aβ del córtex y el bulbo olfatorio, así como de restaurar los niveles de las apolipoproteínas apoE y apoJ (clusterina) en córtex y en hipocampo. En resumen, la presente tesis hace un recorrido desde la obtención inicial y mejora de un fragmento de anticuerpo hasta la demostración de su eficiencia en un modelo murino de la enfermedad de Alzheimer.

Alzheimer's disease (AD) has become a public health problem in developed countries due to social and human health costs. The amyloid cascade hypothesis, the most accepted by the scientific community, places the Aβ peptide as directly responsible for the neuropathological process, specifically Aβ-oligomers. Currently, there are multiple palliative-symptomatic treatments, but none has been described as curative.In recent years, Aβ (amyloid β) immunotherapy has been revealed as a possible tool in Alzheimer’s disease treatment. In contrast with complete antibodies, the administration of scFv (single-chain variable fragments) produces neither meningoencephalitis nor cerebral haemorrhage.The use of scFv-like molecules has achieved promising results in pre-clinical studies. In these chimeric proteins, the VH domain and the VL domain had been fused by a flexible linker, while maintaining the antigenic specificity. In the present thesis, the recombinant expression of scFv-h3D6, a derivative of a monoclonal antibody specific for Aβ-oligomers (mAb-h3D6 or Bapineuzumab) was performed in a bacterial system (E.coli) defective for the two main redox pathways and Trx- and NusA- tagged, Purification of the islolated scFv-h3D6 was achieved by chromatographic techniques. The protein shows the typical immunoglobulin fold. Its biophysical characterization allowed for the observation that heat treatment initiates an aggregation pathway, characterized by a β-rich intermediate state which aggregates in the form of WL (worm-like) fibrils. In the same way, it was shown that its urea-induced unfolding pathway is characterized by the presence of a metaestable intermediate state composed of the unfolded VL domain and the folded VH domain, which suggests the VL domain as a target for thermodynamic stability redesign. The modeling of the 3D structure revealed that the VL domain, located at the C-terminal of the molecule, was ending before its latest β-strand was completed, so, a number of protein variants were created in order to increase the stability of the VL domain. Three elongation mutants, beyond VL-K107, showed increased thermodynamic stability up to 26% and lower aggregation tendency at around 4ºC. These traits shoud be of interest for a molecule with therapeutic potential, since its mean life in vivo should be longer. Additionally, we examined the in vivo effects of the WT scFv-h3D6 in the triple-transgenic 3xTg-AD mouse model of Alzheimer disease. The treatment was applied in a single intraperitoneal dose to five-month-old females, corresponding to the early stages of the disease. Our results suggest that the benefit of scFv-h3D6 occurs at the behavioral cellular and molecular levels; mainly, decreasing Aβ-oligomers in the cortex and olfactory bulb and recovered the non-pathological levels of some apolipoproteins in the cortex (apoE and apoJ) and hippocampus (apoE). In summary, this thesis makes a journey from the initial obtaining and improvement of an antibody fragment to the demonstration of its efficiency in a mouse model of Alzheimer's disease.