Mecanismos de regulación de la muerte del oocito por shock hiperosmótico

Abstract

Las proteínas quinasas p38 y JNK se activan por diversos tipos de estrés ambiental, tal como la radiación UV y el shock hiperosmótico, y regulan múltiples procesos biológicos, entre ellos la proliferación y la muerte celular. El conocimiento de algunas propiedades básicas de estas proteínas quinasas, como la ultrasensibilidad, histéresis y respuesta digital, es importante para el control de los procesos irreversibles. Resultados previos de nuestro grupo han mostrado que el estrés hiperosmótico induce apoptosis en los oocitos de Xenopus laevis y activación de las proteínas quinasas AMPK y JNK. Mediante el uso de este modelo celular, se muestra que p38 también se activa por shock hiperosmótico en los oocitos de Xenopus, que tiene un comportamiento ultrasensible, que no presenta histéresis, y que la activación a nivel de célula individual es bimodal. Por otro lado, se describe el papel de las proteínas quinasas de estrés p38 y JNK, así como la contribución de Smac/DIABLO y las calpaínas, en la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. La inhibición de la vía de p38 con los compuestos SB203580 o BIRB796, o bien la inhibición de la vía de JNK con SP600125, no afectan a la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico, mientras que la inhibición simultánea de la vía de p38 y JNK con SP600125 + BIRB796 inhibe parcialmente la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3. El shock hiperosmótico induce la activación de p38α, p38β, y p38γ. La expresión de un constitutivo activo de MKK6 acelera la apoptosis inducida por shock hiperosmótico, efecto que es inhibido por SB203580 o por BIRB796. Además, la expresión de un constitutivo activo de p38 β acelera la activación de caspasa-3 y la salida de citocromo c inducida por el estrés osmótico, indicando que la isoforma β tiene un papel más pro-apoptótico que el resto de isoformas. La expresión de un constitutivo activo de MEKK1 acelera la apoptosis inducida por el shock osmótico, efecto que es parcialmente inhibido por SP600125 y con mayor claridad por SB203580 y BIRB796, indicando que ambas vías de señalización (JNK y p38) regulan la apoptosis de los oocitos. Por otro lado, el shock hiperosmótico induce la activación de JNK1-1 y JNK1-2 en los oocitos de Xenopus, y la expresión de un constitutivo activo de MKK7 junto con JNK1-1 o JNK1-2 acelera la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. Además, el shock hiperosmótico induce la salida rápida de Smac/DIABLO mitocondrial y la activación de las calpaínas. La inhibición de las calpainas reduce la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3. El bloqueo de Smac/DIABLO inyectando un anticuerpo específico inhibe la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3, indicando que la salida temprana de Smac/DIABLO mitocondrial regula la salida tardía de citocromo c. El inhibidor general de caspasas Z-VAD.fmk retrasa la apoptosis inducida por el estrés hiperosmótico, de forma independiente a la caspasa-3, sugiriendo que alguna otra caspasa podría ser activada antes de la salida de citocromo c. En resumen, la activación sostenida de las proteínas quinasas de estrés p38 y JNK, junto a la salida rápida de Smac/DIABLO al citosol y la activación de las calpaínas son responsables de la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico.

p38 and JNK stress protein kinases are activated by different stimuli like UV and hyperosmotic shock, and regulate multiple biological processes, from proliferation to cell death. Some properties of signalling systems, like ultrasensitivity, hysteresis, and all-or-none responses at a single cell level, are considered to be basic for understanding the regulation of irreversible processes. Previous results in our group have shown that hyperosmotic stress induces apoptosis in Xenopus oocytes and activation of the stress protein kinases AMPK and JNK. Using this cell model, we show now that hyperosmotic shock activates the p38 signalling pathway in oocytes with an ultrasensitive and bimodal response in a time-dependent manner and without hysteresis. Furthermore, we describe the role of stress proteins kinases p38 and JNK, and the contribution of Smac/DIABLO and calpains in the apoptosis induced by hyperosmotic shock. Inhibition of the p38 pathway with the chemical compounds SB203580 or BIRB796, or inhibition of JNK pathway with SP600125 do not block hyperosmotic shock-induced apoptosis, while simultaneous inhibition of p38 and JNK pathways with SP600125 + BIRB796 partially reduces cytochrome c release and caspase-3 activation. Hyperosmotic shock induces activation of p38α, p38β, and p38γ. Expression of a constitutive active MKK6 accelerates apoptosis induced by hyperosmotic shock, an effect that is inhibited by SB203580 or BIRB796. Furthermore, expression of a constitutive active p38β accelerates the activation of caspase-3 and cytochrome c release induced by osmotic stress, indicating that the β isoform has a more pro-apoptotic role that other isoforms. Expression of a constitutive active MEKK1 accelerates apoptosis induced by osmotic shock, an effect that is partially inhibited by SP600125 and more clearly by SB203580 or BIRB796, indicating that both signaling pathways (JNK and p38) regulate apoptosis. Furthermore, hyperosmotic shock induces activation of JNK1-1 and JNK1-2 in Xenopus oocytes, and expression of a constitutive active MKK7 with JNK1-1 or JNK1-2 accelerates apoptosis induced by hyperosmotic shock. In addition, hyperosmotic shock induces rapid release of Smac/DIABLO from the mitochondria and calpain activation. The inhibition of calpains reduces cytochrome c release and caspase-3 activation. Blockage of Smac/DIABLO by injecting a specific antibody inhibits cytochrome c release and caspase-3 activation, indicating that early release of Smac/DIABLO regulates late citocrome c release. The general caspase inhibitor Z-VAD.fmk delays apoptosis induced by hyperosmotic stress, independently of caspase-3, suggesting that some other caspase might be activated before cytochrome c release. In summary, sustained activation of stress protein kinases JNK and p38, combined with rapid release of Smac/DIABLO into the cytosol and activation of calpains are responsible of the cell death induced by hyperosmotic shock.