Efectos del glutatión reducido y la procaína en la resistencia a la criopreservación de semen porcino. Acciones a nivel de la estabilidad nuclear y su efecto en la fertilidad “in vivo”

Abstract

El objetivo de este trabajo fue el de evaluar los efectos de la suplementación con glutatión reducido (GSH) y clorhidrato de procaína (ProHCL) del medio de criopreservación de semen porcino sobre la estabilidad nuclear y la fertilidad “in vivo”. En el primer estudio se comprobó el efecto del GSH y el ProHCL en concentraciones de 1 y 2 mM sobre la estabilización de los puentes disulfuro de las nucleoproteínas, así como la integridad de la cromatina. La fragmentación del DNA se observo a los 240 minutos posteriores a la descongelación. Estas mismas concentraciones de GSH pero no de ProHCL mejoraron parcialmente la integridad del acrosoma y la permeabilidad de membrana, la motilidad total y progresiva, así como los niveles de peróxidos y superóxidos productores de radicales libres de oxigeno (ROS). En el segundo estudio se evaluó la magnitud de las alteraciones en la funcionalidad espermática entre eyaculados buenos congeladores (EBC) y malos congeladores (EMC) durante el proceso de criopreservación y el efecto de mejora del GSH en la criotolerancia de acuerdo con la congelabilidad del eyaculado. Se observaron diferencias entre ambos grupos a la descongelación, pero no durante el proceso de congelación, en la motilidad, integridad de la membrana celular y acrosoma, la estructura de nucleoproteínas y los niveles de fragmentación del ADN en eyaculados. En el tercer estudio se comprobó que la adición de GSH mejoró significativamente la criotolerancia en las muestras EBC, sin diferencias entre 2 mM y 5mM. Por el contrario, la congelabilidad de los EMC se incrementó significativamente sólo cuando se suplementaron con 5 mM de GSH. En el cuarto estudio se comprobó la resistencia a la criopreservación del espermatozoide durante el tiempo de mantenimiento (HT) a 17ºC, evaluando 2 diferentes tiempos (3 y 24 horas de mantenimiento), sobre los parámetros de sobrevivencia celular. A la vez se compararon los niveles de fosforilación de residuos de serina (pSer) en 30 proteínas implicadas en la regulación general de la función espermática. Las 24 horas de HT produjo un aumento significativo en los niveles de pSer de la proteína HSP70, que fue paralelo a un mejoramiento en la viabilidad, motilidad, integridad del acrosoma y estabilización de puentes disulfuro de nucleoproteínas tras la congelación/descongelación. Estos resultados sugieren la existencia de una relación entre los niveles de pSer de proteínas como la HSP70 y la criotolerancia del semen porcino. Por último, en el quinto artículo se determinó la capacidad fecundante del espermatozoide porcino “in vivo”, con la adición de 2mM del GSH al medio de criopreservación conjuntamente con inseminación post-cervical en cerdas multíparas. Se observo un aumento importante y significativo en la tasa de no retorno a estro a 21 días, tasa de gestación a 30 días y tasa de parto, así como en el tamaño de camada determinado por lechones totales y vivos. Además, estos parámetros reproductivos se correlacionaron significativamente con los niveles de residuos de cisteína libre de la cabeza espermática y, en menor medida, con otros estimadores de la calidad seminal, como la fragmentación del ADN, la integridad de acrosoma, la viabilidad, motilidad progresiva y la producción de ROS. Por lo tanto, los resultados indican que la adición de GSH mejora de forma significativa los resultados obtenidos con la inseminación con semen congelado en porcino. Como conclusión general, estos estudios muestran que la adición de GSH y ProHCL participan en grado similar en el mantenimiento de la integridad de la estructura nucleoproteica para la estabilización de la cromatina, punto crucial para el funcionamiento y fertilidad “in vivo” del espermatozoide porcino. También se demostró que la magnitud de daño en parámetros de función espermática durante el proceso de criopreservación es mayor en eyaculados EMC. Por lo tanto los EMC necesitan una mayor concentración de GSH que los EBC para mejorar su criotolerancia. Por otra parte, el espermatozoide porcino modula su funcionamiento durante el TH de 24 horas incrementando su criotolerancia mediante cambios en los niveles de pSer de proteínas ligadas a la resistencia ambiental. Finalmente, la adición de GSH en el medio de congelación parece ser una técnica de utilidad para la mejora de los resultados de inseminación con semen congelado en porcino.

The aim of this study was to evaluate the effects of supplementation with reduced glutathione (GSH) and procaine hydrochloride (ProHCL) medium boar semen cryopreservation on nuclear stability and “in vivo” fertility. In the first study, the effect of GSH and the ProHCL at concentrations of 1 and 2 mM of stabilizing disulfide bonds the nucleoproteins and chromatin integrity. DNA fragmentation was observed at 240 minutes after thawing. The same concentrations of GSH but partially improved ProHCL acrosome integrity and membrane permeability, total and progressive motility, as well as the levels of peroxides and superoxides producing oxygen free radicals (ROS). In the second study the magnitude of the changes in functionality between good freezability ejaculates (GFE) or poor freezability ejaculates (PFE) evaluated during the cryopreservation process and the effect of GSH in improving cold tolerance according to ejaculate freezability. Differences between groups were observed thawing, but not during the freezing process, motility, integrity of the cell membrane and acrosome, the nucleoprotein structure and levels of DNA fragmentation in ejaculated.

In the third study found that the addition of GSH significantly improved cold tolerance in GFE samples, with no difference between 2 mM and 5 mM. In contrast, the PFE freezability increased significantly only when supplemented with 5 mM GSH. In the fourth study resistance of sperm cryopreservation was found during the holding time (HT) at 17 °C, evaluating 2 different times (3 and 24 hours of maintenance), on parameters of cell survival. While the levels of phosphorylation of serine residues (pSer) in 30 proteins involved in the overall regulation of sperm function were compared. At 24 hours of HT produced a significant increase in the levels of pSer the HSP70 protein, which was parallel to an improvement in viability, motility, acrosome integrity and disulfide bonds stabilization the nucleoprotein after freezing / thawing. These results suggest the existence of a relationship between levels of pSer protein as HSP70 and cold tolerance of porcine semen. Finally, in the fifth article the fertilizing capacity of boar spermatozoa “in vivo”, with the addition of 2 mM GSH to the cryopreservation medium together with post -cervical insemination in sows was determined. An important and significant increase in the rate of non-return to estrus 21 days, pregnancy rate at 30 days and farrowing rate and the litter size determined by total and live piglets was observed. Furthermore, these reproductive parameters were significantly correlated with the levels of free cysteine residues of the sperm head and to a lesser extent, other estimators of semen quality, such as DNA fragmentation, acrosome integrity, viability, progressive motility and production of ROS. Therefore, the results indicate that the addition of GSH significantly improves the results obtained with the pig insemination with frozen semen. As a general conclusion, these studies show that the addition of GSH and similar degree ProHCL involved in maintaining the integrity of the nucleoprotein structure of chromatin stabilization, crucial for the functioning and improvement of fertility “in vivo” porcine sperm. It was also shown that the magnitude of damage in sperm function parameters during cryopreservation is higher in ejaculates PFE. Therefore the need PFE, GSH concentration greater than GFE to improve cold tolerance. Moreover, the boar spermatozoa modulate TH during 24 hours by increasing its cryotolerance changes of pSer levels of protein linked to the environmental resistance. Finally, addition of GSH in the freezing medium appears to be a useful technique for improving the results of pig insemination with frozen semen.