Preservación del patrón metabolómico de tejidos mediante fijación por irradiación con microondas focalizadas. Aplicación al estudio del tejido cerebral normal y patológico mediante espectroscopía HRMAS y metodologías de reconocimiento de patrones

Abstract

Los tumores cerebrales se desarrollan dentro del sistema nervioso central y pueden ser originados por células del mismo sistema nervioso, o bien tratarse de una metástasis con origen en un órgano distinto. Representan menos de un 2% del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial, pero a pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. El diagnóstico de este tipo de tumores generalmente se lleva a cabo mediante técnicas de imagen (IRM) y espectroscopía (ERM) por resonancia magnética nuclear (RMN) gracias a sus características morfológicas y aspectos bioquímicos diferenciales. La ERM está considerada como el método no invasivo que permite estudiar más adecuadamente el metabolismo de los seres vivos ya que puede determinar cualitativa y cuantitativamente una gran variedad de metabolitos en el tejido intacto, proporcionando una información extensa sobre su composición. Sin embargo queda limitada por una baja resolución espectral, en comparación con la resolución que se puede llegar a obtener con los análisis in vitro. En ese sentido, la evaluación in vitro de biopsias de tumores cerebrales mediante la técnica de espectroscopía de alta resolución “high resolution magic angle spinning spectroscopy” (HRMAS) complementa la información bioquímica obtenida in vivo y en muchos casos puede contribuir a mejorar el diagnóstico no invasivo y manejo de la enfermedad. La espectroscopía HRMAS consiste en hacer girar una muestra a altas velocidades en un ángulo de 54,7o respecto al campo magnético principal. Este tipo de adquisición reduce la anchura de las señales detectados en el espectro de RMN que viene principalmente causada por las interacciones dipolares entre núcleos de la muestra, con contribuciones adicionales de la heterogeneidad de la muestra y parámetros residuales anisotrópicos. Los métodos de manipulación de muestras de tejido para su análisis por HRMAS son relevantes y pueden interferir en los resultados. La obtención, conservación y temperatura a la que están sometidas las muestras pueden ser determinantes y desencadenar el metabolismo post mortem. A ese respecto, el uso de la irradiación por microondas focalizadas (FMW) puede ser una opción eficiente, actuando rápidamente y causando la inactivación de dicho metabolismo postmortem. Este método es ampliamente utilizado para el sacrificio de animales y capaz de preservar el metaboloma de muestras o tejidos. En esta tesis se han desarrollado distintas optimizaciones y estudios alrededor de la irradiación por FMW. En un primer momento, se estudió la influencia del método de sacrificio (sobredosis de anestesia vs. irradiación por FMW) en el patrón espectral HRMAS de tejidos obtenidos de modelos preclínicos de tumor glial de alto grado (GL261) y de isquemia cerebral en rata. Luego, se ha desarrollado una estrategia para minimizar los cambios en el patrón espectral de tejido cerebral y patológico mediante protocolos de fijación por irradiación FMW previa al análisis HRMAS, en muestras que habían sido sometidas a la congelación. Dicho método se desarrolló con vistas a su aplicación a biopsias de tumores cerebrales humanos. Paralelamente, se llevaron a cabo estrategias de reconocimientos de patrones espectrales con espectros HRMAS adquiridos de muestras de tumores cerebrales humanos. Estas estrategias, aparte de validar el uso del programa SpectraClassifier (desarrollado en el grupo de investigación) como herramienta para reconocimiento de patrones, en el caso de espectros HRMAS también estudió la posible influencia de la temperatura y secuencias de adquisición sobre el rendimiento de los clasificadores desarrollados. Se ha comprobado además que la irradiación por FMW de las biopsias de tumores, aunque no se refleja en una mejora sustancial en el rendimiento del clasificador, no parece tener una influencia negativa sobre éste y puede ser utilizada como método de preservación del patrón espectral de las biopsias investigadas.

Brain tumors develop within the central nervous system and could originate from nervous system itself or they can be due to a metastasis originating from a different organ. They represent less than 2 % of all diagnosed cases of cancer each year worldwide, but despite this, they are a major source of mortality and disability. Their diagnosis is generally carried out by nuclear magnetic resonance (NMR) techniques, both imaging (MRI) and spectroscopy (MRS) due to their differential morphological and biochemical characteristics. MRS is considered one of the best noninvasive methods to study metabolism of living beings, due to its ability for assessing both qualitatively and quantitatively a panoply of metabolites in the intact tissue, providing extensive information on its composition. However, there are limitations related to the relatively low spectral resolution achieved, in comparison with the in vitro studies resolution. In this sense, the in vitro evaluation of brain tumor biopsies using the high resolution magic angle spinning spectroscopy (HRMAS) technique could complement the biochemical information obtained through in vivo studies, and could help to improve diagnosis and management of disease. The HRMAS spectroscopy technique consists in spinning the sample at high speeds with an angle of 54.7o respect to the main magnetic field. This type of acquisition reduces the width of the spectral signals which are due mainly to the dipolar interactions, which are caused, in turn, by intrinsec factors of the sample and residual anisotropic parameters. The handling methods for tissue samples which will be used in HRMAS analysis are relevant and could interfere with the final result. The collection, storage and temperature conditions of the samples could be determining and could also induce post mortem metabolism. In this respect, the use of focused microwave irradiation (FMW) could be an efficient option, acting in a fast way and inactivating any postmortem metabolism. FMW fixation is a widely used method for animal sacrifice, in order to preserve the metabolome of tissue samples. In this thesis we have developed different studies around the FMW irradiation. First, we have studied the influence of the method used for animal sacrifice (anaesthesia overdose vs. FMW irradiation) in the spectral pattern of tissue samples from preclinical high grade tumors (GL261) and samples from preclinical models of ischaemic rat brain. Afterwards, we have developed a strategy to minimize spectral pattern changes of normal and pathological brain tissue through FMW irradiation prior to HRMAS analysis in previously frozen samples. This method was developed with the objective of its application to human brain tumor biopsies. In parallel, pattern recognition studies were carried out with HRMAS spectra acquired from those human brain tumor biopsies. These studies, besides of making possible the validation of SpectraClassifier software (developed in house within the research group where this thesis was performed) as a pattern recognition tool for HRMAS spectra, also assessed the influence of temperature and acquisition sequence in the performance of the developed classifiers. It has been proved, in addition, that although the FMW irradiation of the biopsies does not have a substantial impact in the classifier performance, it does not seem to have a negative influence over it, and could be used as a spectral pattern preservation method for studies of human brain tumors biopsies.