Development and optimization of the attB system to produce Helper-dependent Adenovirus vectors of different species

Abstract

Els adenovirus helper-depenents (HDAd) són vectors molt atractius per teràpia gènica perquè tenen una gran capacitat de clonatge, poden infectar una àmplia varietat de tipus cel·lulars, independentment del seu estat de proliferació, i indueixen una expressió prolongada del transgèn sense toxicitat crònica. La producció d´aquests vectors ha estat àmpliament optimitzada fins al punt en que produccions de nivell clínic poden ser obtingudes amb nivells reduïts de contaminació per adenovirus helper. Tot i això, aquests mètodes encara han de ser millorats, ja que la majoria d´aquests no són escalables i, per tant, requereixen una quantitat considerable de temps i esforç per obtenir preparacions a gran escala. Malgrat la constant optimització de la producció de HDAd, encara existeix preocupació per l´aplicació clínica d´aquests vectors a causa de que la resposta immune humoral contra la càpside viral limita la seva eficiència, mentre que la resposta immune innata limita la seva bioseguretat. En aquest aspecte, l´ús de HDAd no humans per tal d´evitar la resposta immune sembla una opció molt prometedora per la seva aplicació en assajos clínics. Tot i això, la producció d´aquests vectors encara no ha estat suficientment optimitzada, i normalment produeix baixos nivells de títols infecciosos amb un elevat grau de contaminació per adenovirus helper que impedeix el seu ús en assajos clínics. A més a més, per millorar la bioseguretat i eficàcia d´aquests vectors, diferents estratègies basades en la modulació de les interaccions entre les proteïnes fiber dels virus i els receptors cel·lulars s´estan testant. Els elevats nivells de transducció d´aquests vectors quimèrics permetria assolir nivells terapèutics del vector a dosis baixes, fent que siguin més segurs a la clínica. Per altra banda, la modificació de la càpside pot ser utilitzada per generar vectors capaços de transduïr un sol tipus de cèl·lula diana específica, permetent el control del tropisme i, per tant, evitant una distribució generalitzada del vector, resultant un gran avenc en termes de bioseguretat. En aquest aspecte, la generació de sistemes de produir HDAd quimèrics és molt interessant, ja que aquests vectors combinen les anomenades avantatges dels vectors quimèrics i la bioseguretat dels HDAds.

Helper-dependent adenovirus (HDAd) are very attractive vectors for gene therapy because they have a large cloning capacity and can infect a wide variety of cell types, regardless of their proliferation state, and result in long-term transgene expression without chronic toxicity. The production of these vectors has been widely optimized up to a level where clinical-grade productions can be achieved with very low helper-Ad contamination levels. However, this methods still need to be improved, as most of them are not scalable and therefore require an important amount of time and effort to achieve large-scale preparations. Despite the ongoing optimization of HDAd production, there is still concern for the clinical application of HDAd vectors because the humoral immune response against the viral capsid limits their efficiency, while the innate immune response limits their biosafety. In this regard, the use of non-human-derived HDAd vectors to avoid the immune response seems to be a very promising option for their application in clinical trials. However, the production of these vectors has not been sufficiently optimized yet, generally producing low infectious titers with levels of helper contamination that do not permit their use in clinical trials. Also, to improve the biosafety and efficacy of HDAd vectors, different strategies based on modulating the interaction between viral fiber proteins and the cellular receptors by capsid modification are currently being tested. The higher transduction efficiencies of these chimeric vectors would allow therapeutic levels of the vector using lower doses, making them safer in the clinic. Also, capsid modification could be performed to generate vectors capable of only transducing a specific target cell, allowing the control of vector tropism, and therefore avoiding a widespread distribution of the vector, which would be an important step forward in terms of biosafety. In this regard, the generation of systems to produce chimeric HDAd is very interesting, as these vectors combine the mentioned advantages of chimeric vectors and the biosafety of HDAds. In this thesis we developed and optimized HDAd production strategies for these vectors based on the use of helper-Ad with the attB sequence of ΦC31 recombinase, which causes a delay on the viral life cycle of these vectors, allowing a preferential amplification of HDAd without requiring the use of cell lines with Cre recombinase expression.