Estudio de la fosforilación de eIF4E y del factor 4E-T en situaciones de estrés celular en cáncer de mama

Abstract

En los últimos años se ha descrito la desregulación de la síntesis proteica en muchas enfermedades, esto ha incrementado la investigación de nuevos mecanismos que controlan la expresión génica, en particular a nivel del inicio de la traducción. La mayor enfermedad con alteraciones en la traducción de mRNAs es el cáncer, donde se han encontrado desregulados varios factores implicados en el inicio de la traducción, incluyendo el eFI4E, eIF4G y 4E-BPs. Hipotetizamos que la regulación del inicio de la traducción es importante para la respuesta y la resistencia al estrés celular que ocurre durante el desarrollo del tumor. Nuestro estudio se centra en el factor de inicio de la traducción eIF4E (y su proteína de unión 4E-T) en cáncer de mama, donde se ha observado que elevados niveles de eIF4E se encuentran asociados con la malignidad y un peor pronóstico. La fosforilación de la serina 209 de eFI4E parece ser esencial para las propiedades tumorigénicas de eIF4E. Hemos analizado el rol de la fosforilación de eIF4E en diferentes líneas celulares tumorales bajo diferentes situaciones de estrés como el tratamiento con arsénico (estrés oxidativo), la deprivación de nutrientes y el tratamiento con drogas quimioterapéuticas (cisplatino). Mediante la utilización de un mutante hipofosforilado y un mutante fosfomimético de eIF4E, observamos que la fosforilación de eIF4E aumentaba la resistencia celular tras una situación de estrés, así como inhibía la apoptosis, correlacionándose con un aumento de ciertas proteínas relacionadas con la proliferación, como es el caso de Ciclina D1, y un incremento de proteínas antiapoptóticas, como es el caso de Mcl-1. El tratamiento con arsénico conduce a un bloqueo mayor de la traducción de proteínas en células que expresan el mutante fosfomimético, una vez regresado a las condiciones normales la sobreexpresión de este mutante permite una recuperación más rápida de la síntesis de proteínas normal. La sobreexpresión del mutante fosfomimético conduce a la formación de unos cuerpos citoplasmáticos que colocalizan con la proteína 4E-T. Este complejo peIF4E/4E-T también interacciona con las proteínas Ago2 y HuR. La inhibición de la expresión de 4E-T, HuR y/o Ago2, inhibe la recuperación celular, tras determinadas situaciones de estrés, mediada por peIF4E. Debido que la interacción de eIF4E con 4E-T parece ser esencial para la función de la fosforialción de eIF4E en respuesta a estrés, especulamos que este factor también juega un papel importante en el proceso tumorigénico. En efecto, la sobreexpresión de 4E-T incrementa los niveles de N-cadherina y de las metaloproteinasas -3 y -9. A parte se observa un incremento de la migración e invasión al sobreexpresar 4E-T; por el contrario, observamos una disminución de la invasión y migración al inhibir la expresión de 4E-T o al utilizar el mutante de 4E-T incapaz de unirse a eIF4E o, cuando inhibimos la fosforilación de eIF4E. Estos resultados nos indican que la interacción peIF4E/4E-T regula la invasión y la migración celular. Finalmente, realizamos unas inmunohistoquímicas de 77 tumores de mama. Se encontraron altos niveles de eIF4E y peIF4E, los cuales se correlacionaban con el tamaño del tumor. En el caso de 4E-T, este correlacionaba con altos niveles de N-cadherina, tal y como observamos in vitro al sobreexpresar 4E-T. En conclusión, hemos identificado el complejo peIF4E/4E-T como un complejo regulador de la resistencia a estrés y de la invasión y migración celular. El estudio de este complejo ofrece nuevas oportunidades terapéuticas contra el cáncer.

Deregulated protein synthesis has been described in many diseases in recent years, stimulating further research into the mechanisms that control gene expression, in particular at the level of translational initiation. A major disease with alterations to RNA translation is cancer, in which deregulated expression of many initiation factors including eIF4E, eIF4G and 4E-BPs, is frequently observed. We hypothesized that regulation of translational initiation is also important for the response and resistance to cellular stress that occur during tumor development. Our study focused on the translation initiation factor eIF4E (and its binding partner 4E-T) in breast cancer, where high levels of eIF4E are associated with malignancy and poor prognosis. Phosphorylation of Ser 209 appears to be essential for the tumourigenic properties of eIF4E. We therefore analyzed the role of eIF4E phosphorylation in different tumor cell lines, in particular the cellular response to different stress inducers such as arsenite (oxidative), nutrient deprivation, and chemotherapeutic drugs (cisplatin). Using phospho-dead and phosphomimetic mutants of eIF4E, we observe that phosphorylated eIF4E increase the cellular resistance to stress and inhibit apoptosis, correlating with an increase of some proteins related to proliferation, such as Cyclin D1, and an increased expression of anti-apoptotic proteins including Mcl-1. Arsenite treatment lead to a greater immediate block of translation in cells expressing the phosphomimetic mutant, but this appeared to allow for a faster recovery to normal protein synthesis upon returning the cells to normal conditions. Overexpression of the phosphomimetic mutant led to de novo formation of unique cytoplasmic bodies which co-localized with 4E-T protein. This peIF4E/4E-T complex also appeared to interact with Ago2 and HuR. The downregulation of 4E-T, HuR or/and Ago2, inhibited peIF4E-mediated cellular recovery after some stress situations. As the eIF4E interaction partner 4E-T appeared to be essential for the phospho-specific function of eIF4E in response to stress, we speculated that this factor also may play a central role in the tumourigenic process. Indeed, overexpression of 4E-T increased the levels of N-cadherin and matrix metalloproteinase -3 and -9. We also observed an increase in the migration and invasion capacity of these cells, In contrast, decreased invasion was observed when knocking down 4E-T expression, or when using a mutant of 4E-T unable to bind eIF4E, or when we inhibited the phosphorylation of eIF4E. These results indicate that the interaction peIF4E/4E-T regulate cellular invasion and migration. Finally, we performed an immunohistochemistry study of 77 breast tumors. High levels of eIF4E and phospho eIF4E correlated with the size of the tumor, whereas high levels of 4E-T correlated with increased N-cadherin expression as observed after 4E-T overexpression in vitro. In conclusion, we have identified the peIF4E/4E-T complex as a regulator of malignant features including cellular resistance to stress and a higher invasive capacity. Further elucidation of this complex is warranted and provides new therapeutic opportunities against cancer.