Apoptosis-based immunotheraphy for thype 1 diabetes: from dendritic cells to antigen-specific liposomes

Abstract

La diabetis tipus 1 (DT1) és una malaltia metabòlica causada per la destrucció selectiva de les cèl·lules β pancreàtiques productores d’insulina per part del sistema immunitari. Actualment no hi ha cura ni prevenció per restaurar la secreció endògena d’insulina als pacients amb DT1. Per tant, un important repte biomèdic és el desenvolupament de noves teràpies per recuperar la tolerància immunològica. Una immunoteràpia ideal hauria d’inhibir la resposta autoimmunitària, sense efectes sistèmics adversos, i permetre la regeneració de les cèl·lules insulars per tal de recuperar la massa β. Hi ha mecanismes fisiològics que contribueixen a mantenir la tolerància immunològica. D’una banda, les cèl·lules apoptòtiques són una important font d’autoantígens que indueixen tolerància després de ser fagocitades per les cèl·lules presentadores d’antigen a través d’un procés anomenat eferocitosi. D’altra banda, les cèl·lules dendrítiques (CDs) són potents presentadores d’antigen amb capacitat de mantenir la tolerància immunològica. Basant-nos en aquestes dues característiques de la resposta immunitària, la hipòtesi del present treball és que les característiques tolerogèniques adquirides per les cèl·lules presentadores d’antigen després de l’eferocitosi poden ajudar a recuperar la tolerància perduda durant l’autoimmunitat. El principal objectiu ha estat generar una immunoteràpia antigen-específica basada en les propietats tolerogèniques inherents a l’apoptosi, per tal de restablir la tolerància a les cèl·lules β en la diabetis autoimmunitària.

Amb aquesta finalitat, hem generat una immunoteràpia cel·lular amb CDs que havien capturat cèl·lules β apoptòtiques. Després de l’eferocitosi, les CDs van mostrar un canvi de patró molecular cap a un fenotip tolerogènic i una baixa producció de citocines proinflamatòries, mostrant també una disminució de la seva capacitat d’estimular la proliferació de cèl·lules T autòlogues. Això es va observar fins i tot després d’un estímul proinflamatori, fet que recolza l’estabilitat d’aquestes CDs tolerogèniques. A més, l’eferocitosi va promoure funció supresora en les CDs, un fenomen mediat -al menys en part- per la prostaglandina E2. L’administració d’aquesta immunoteràpia al model més utilitzat de DT1, el ratolí no-obès diabètic (NOD), va aturar la progressió de la insulitis i va prevenir la diabetis. Malgrat això, no va ser possible revertir la malaltia en ratolins diabètics.

Degut a la dificultat en obtenir i estandarditzar les cèl·lules β apoptòtiques, vam dissenyar una estratègia sintètica, basada en les micropartícules liposomals. Els liposomes són vesícules formades per una bicapa lipídica amb un nucli hidrofílic. Una característica clau en el reconeixement de les cèl·lules apoptòtiques és l’exposició a la membrana de la molècula fosfatidilserina (FS), que genera el principal senyal de reconeixement per l’eferocitosi. Per tant, vam generar FS-liposomes amb pèptids d’insulina a l’interior -com a autoantígens-, per tal de simular el reconeixement de les cèl·lules apoptòtiques per part de les cèl·lules presentadores d’antigen. Aquests liposomes van ser fagocitats per les CDs, resultant en la inducció de tolerància i disminuint la capacitat d’induir proliferació en els limfòcits T autoreactius, de manera similar a la teràpia cel·lular de CDs. A més, aquesta immunoteràpia sintètica va ser capaç d’aturar l’atac autoimmunitari, reduint la severitat del infiltrat insular i prevenint la DT1 en ratolins NOD.

Les característiques tolerogèniques de l’apoptosi ens van portar a dissenyar una teràpia cel·lular i posteriorment, a encapsular autoantígens en liposomes per induir una immunosupressió específica. El mimetisme de l’apoptosi utilitzant liposomes pot oferir una solució a la complexitat de la teràpia cel·lular, amb avantatges en quant a baix cost i la possibilitat de producció a gran escala, estandardització i personalització. Malgrat cal aprofundir molt en aquest camp, l’aportació al camp clínic de les immunoteràpies presentades en aquest treball pot ser molt important, donat el seu potencial translacional en situacions que requereixen el restabliment de la tolerància immunològica, com ara les malalties autoimmunitàries.

Type 1 diabetes (T1D) is a metabolic disease that results from the autoimmune attack against insulin-producing β-cells in the pancreatic islets of Langerhans. Currently, there is no treatment to restore endogenous insulin secretion in patients with T1D, so the development of new therapies to induce long-term tolerance has been an important medical health challenge. An ideal immunotherapy should inhibit the autoimmune attack, avoiding systemic side effects and allowing islet regeneration to improve β-cell function. There are physiological mechanisms that contribute to the maintenance of immune tolerance. On one hand, apoptotic cells are a source of autoantigens that induce tolerance after its removal by antigen presenting cells through a process called efferocytosis. On the other, dendritic cells (DCs) are powerful antigen presenting cells capable of maintaining immunological tolerance. Based on these two traits of the immune system, we hypothesized that tolerogenic features acquired by antigen presenting cells after efferocytosis can help to restore tolerance lost in autoimmunity. The main goal of this study was to generate an antigen-specific immunotherapy based on the inherent tolerogenic properties of apoptosis to reestablish tolerance to β-cells in T1D.

To that aim, we generated a cell-based immunotherapy with DCs loaded with apoptotic β-cells. After the uptake of apoptotic β-cells, DCs displayed a molecular switch to a tolerogenic phenotype, low secretion of proinflammatory cytokine and impaired ability to stimulate autologous T cell proliferation even after proinflammatory stimuli, thus demonstrating their stability. Moreover, efferocytosis promoted suppressive ability in DCs, mediated at least in part by prostaglandin E2. The administration of the DC-based immunotherapy to the gold standard animal model for T1D, the non-obese diabetic (NOD) mouse, impaired the progress of insulitis, resulting in the prevention of the disease. However, it was not able to reverse the disease in overtly diabetic in mice.

Due to the difficulties in obtaining and standardizing β-cell apoptotic cells, we designed a synthetic strategy, based on liposomal microparticles. Liposomes are vesicles composed of a lipid bilayer with a hydrophilic center. A central event on the surface of apoptotic cells is the exposure of phosphatidylserine (PS), which provide the main signal for efferocytosis. Therefore, PS-liposomes loaded with insulin peptides -as autoantigens- were generated to simulate the PS recognition of apoptotic cells by antigen presenting cells. These liposomes were phagocyted by DCs resulting in tolerance induction and impairing autoreactive T cell proliferation, in a similar way than the DC-based immunotherapy. In addition, this synthetic immunotherapy arrested the autoimmune aggression, reduced the severity of insulitis and prevented T1D in NOD mice.

The fact that efferocytosis contributes to the maintenance of self-tolerance led us to design a cell therapy and later, to encapsulate β-cell autoantigens in liposomes to induce specific immunosuppression. Apoptotic mimicry using liposomes can offer a solution to the complexity of cell-therapy with design benefits like low-cost and easy to standardize, large-scale production and customization. Although further research is needed, the clinical relevance of the herein proposed immunotherapies could prove to be very important, as it has translational potential in situations that require the reestablishment of immunological tolerance, such as autoimmune diseases.