Manipulació genètica del pàncrees per a l'estudi de la diabetis

Abstract

La diabetis és una de les malalties més comunes. Els dos tipus principals són, la tipus 1 i la tipus 2, i es caracteritzen pel desenvolupament d’hiperglucèmia. En la diabetis tipus 1, aquest increment en la glucèmia apareix com a conseqüència d’una disminució de la massa de cèl·lula β i una pèrdua de funcionalitat dels illots. Per tant, restablir una massa de cèl·lula β capaç de mantenir una adequada homeòstasi de la glucosa és un dels principals reptes de la medicina regenerativa pel tractament de la Diabetis. Per avaluar l’eficàcia d’aquests nous tractaments seria de gran interès disposar d’eines que permetin manipular genèticament el pàncrees in vivo. En aquest estudi, s’han desenvolupat tres aproximacions clau per a l’anàlisi de la massa de les cèl·lules β i de les cèl·lules acinars del pàncrees: un ratolí transgènic RIP-I/β-Gal el qual expressa la β-Galactosidasa (β-Gal) de forma específica a les cèl·lules β del pàncrees, i vectors virals Adeno-associats (AAV) i Adenovirus helper dependents (HdAd) que expressen diferents gens marcadors. En primer lloc s’ha generat el ratolí transgènic RIP-I/β-Gal per poder avaluar possibles canvis en la massa de cèl·lula β al llarg del temps i/o en processos patològics com la diabetis. De tots els animals fundadors obtinguts, només una de les línies, la L5, la de menor nombre de còpies presentava una elevada expressió de la β-Gal als illots pancreàtics, sent aproximadament el 90% de cèl·lules β del illot doble positives Ins+/β-Gal+. També, s’han dissenyat i produït vectors virals HdAd i AAV que expressen el gens reporters GFP o seAP (secreted Alkaline Phosphatase) específicament a les cèl·lules β o exocrines segons els promotor utilitzat, promotor d’insulina (hIns) o Elastasa, respectivament. Els HdAd, a diferència dels AAV, presenten una major capacitat de clonatge però la seva producció és més complexa. Després de la transducció via intraductal del pàncrees dels vectors HdAd-CMV-GFP o HdAd-Elastasa-GFP es va observar una disminució significativa de l’expressió de GFP als pocs dies de la injecció, degut a una forta infiltració limfocitària causada principalment per l’expressió de GFP. En canvi, quan s’utilitzava un marcador no immunogènic com la seAP l’expressió era detectada a llarg termini. Aquests resultats demostren per primer cop que la transducció del pàncrees exocrí i endocrí mitjançant vectors HdAd és possible i que l’expressió del gen d’interès es manté durant un període de temps llarg. En paral·lel als estudis amb els HdAd, s’ha demostrat la transducció al pàncrees exocrí i endocrí quan s’injectaven els vectors de serotip 9 (AAV9) per via intraductal i intravenosa a ratolins. Animals injectats per via intraductal amb els vectors AAV9-Elastasa-seAP mostraven nivells de seAP circulants a llarg termini. Aquests vectors han estat útils per avaluar les diferències de transducció segons la via d’administració i la soca de ratolí utilitzada, observant-se una elevada transducció en els ratolins C57Bl6 independentment de la via d’administració. La regeneració de cèl·lules β in vivo ha esdevingut un mètode prometedor per al tractament de la diabetis tipus 1. Donada l’eficiència i seguretat de les estratègies de transferència gènica mitjançant els vectors virals AAV, es van utilitzar aquests vectors per a transferir gens clau per a reprogramar les cèl·lules acinars del pàncrees cap a un fenotip β en ratolins diabètics immunocompetents. En aquest estudi es van utilitzar tres factors de transcripció claus implicats en el desenvolupament de la cèl·lula β: Pdx1 (Pancreas and duodenal homeobox gene-1), Neurog3 (Neurogenin 3) i MafA (PNM). Es va observar un increment estadísticament significatiu de l’expressió ectòpica dels tres factors al pàncrees i un increment de l’expressió de la insulina, tot i que no hem aconseguit disminuir la hiperglucèmia dels ratolins C57Bl6 diabètics. Però quan es van coinjectar els AAV9-PNM amb un Ad5-nul no codificant es va aconseguir una reprogramació parcial de les cèl·lules exocrines en productores d’insulina observant-se una expressió significativa del gen Ins1 (Insulina 1) i una disminució de les glucèmies dels ratolins diabètics. Per tant, les aproximacions desenvolupades en aquesta tesi han demostrat que la manipulació genètica del pàncrees, tant de les cèl·lules endocrines com de les exocrines, poden ser molt útils per avaluar possibles teràpies per a la diabetis o en altres malalties pancreàtiques.

Diabetes is one of the most common diseases. The two main types are the Type 1 and Type 2 Diabetes and are characterized by the development of hyperglycaemia. In type 1 Diabetes, the increase in glucose levels results from a decrease in β-cell mass and loss of islet functionality. Therefore, recover the β cell mass to maintain an appropriate glucose homeostasis is one of the main challenges of regenerative medicine for diabetes treatment. To evaluate the effectiveness of these new diabetes treatments it would be of great interest to have tools to analyse pancreas cells (endocrine and exocrine) in vivo. In this study, we have developed three key approaches to analyse the pancreatic β cell mass and acinar cells: a RIP-I/β-Gal transgenic mouse that overexpresses β-Galactosidase (β-Gal) specifically in pancreatic β cells and adeno-associated viral vectors (AAV) and Adenoviral helper-dependent vectors (HdAd) expressing different markers. First, we generated the transgenic mice RIP-I/β-Gal to assess possible changes in β cell mass over the time and/or pathological processes such as diabetes. Only one of obtained lines, L5, with lower copy number, showed a high expression of β-Gal in pancreatic islets, being approximately 90% of β cells double positive for Ins+/β-Gal+. Furthermore, we have designed and produced HdAd and AAV viral vectors expressing reporter genes such as GFP (Green Fluorescent Protein) or seAP (secreted Alkaline Phosphatase) specifically in β cells or in exocrine cells, according to the promoter used, insulin (hIns) or elastase promoter, respectively. The HdAd, unlike AAV, has higher cloning capacity, but the production is more complex. After the transduction of the pancreas following the intraductal administration of HdAd-CMV-GFP or HdAd-elastase-GFP vectors, a significant decrease in GFP expression was shown few days after injection, due to a strong lymphocyte infiltration caused mainly by overexpression of GFP. However, when we used the seAP non-immunogenic marker, the seAP expression was detected long term. These results demonstrate for the first time that the endocrine and exocrine pancreas transduction by HdAd vectors is possible and that the expression of the gene of interest is maintained for a long period of time. In parallel with HdAd studies, the endocrine and exocrine pancreas transduction has also been achieved when AAV serotype 9 vectors (AAV9) have been administered intravenously or intraductaly. The animals injected intraductaly with AAV9-elastase-seAP vectors showed long term higher seAP circulating levels. These vectors have been useful for assessing differences in transduction levels according to the administration route and the mouse strain used. Therefore, we have observed a high transduction in C57Bl6 mice regardless of the route of administration. The in vivo β cell regeneration has become a promising method for Type 1 Diabetes treatment. Given the efficiency and safety of gene transfer strategies using AAV viral vectors, these vectors were used to transfer key genes with the aim to reprogram pancreatic acinar cells into β phenotype cells, in immunocompetent diabetic mice. In this study we used three key transcription factors involved in the development of β cell: Pdx1 (Pancreas and duodenal homeobox gene-1), Neurog3 (Neurogenin3) and Mafa. We observed a significant increase of the pancreas ectopic expression of the three factors resulting in enhanced insulin expression, although the hyperglycaemia was not reduced in diabetic C57Bl/6 mice. When we coinjected AAV9-PNM (Pdx1, Neurog3, Mafa) vectors with an Ad5-null non-coding vector, partial reprogramming of exocrine cells into insulin-producing cells was achieved with a significant expression of Ins1 (Insulin 1) gene and a decrease on glycaemia of diabetic mice. Therefore, the approaches developed in this thesis have shown that the genetic manipulation of the pancreas, exocrine and endocrine cells, could be very useful for evaluating potential therapies for diabetes or other pancreatic diseases.