Optimización del protocolo de crioconservación de semen caprino de la raza autóctona en peligro de extinción Blanca de Rasquera

Abstract

El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue optimizar la crioconservación de semen caprino de la raza Blanca de Rasquera. Para ello, se diseñaron 4 estudios. En el primer estudio se evaluó la sustitución de la yema de huevo fresco por yema de huevo en polvo (YHP), para reducir el riesgo de contaminación microbiológica del diluyente, así como el efecto de la yema de huevo fresco clarificado obtenida por centrifugación ultrarrápida. Simultáneamente, se evaluó la presencia de plasma seminal en la congelabilidad espermática de donantes de uno y dos años de edad. En el segundo, se estudió la sustitución de los crioprotectores penetrante (glicerol vs trehalosa) y no penetrante (YHP vs lecitina de soja (LS)), así como la inclusión del antioxidante BHT y el tampón zwitteriónico Test, en lugar del Tris, en los diluyentes. En el tercer trabajo, se analizó la lecitina de soja como alternativa viable en la conservación de espermatozoides caprinos en presencia de plasma seminal, así como la concentración óptima del antioxidante BHT en los diluyentes a base de YHP o LS. Por último, en el cuarto estudio se valoró la calidad espermática a lo largo de todo el año, la adición de antioxidantes (BHT o melatonina) en los diluyentes y la aplicación de implantes de melatonina en los sementales en primavera, además de valorar el efecto de la edad y del individuo en la congelabilidad de los espermatozoides caprinos.

Tras un complejo análisis de la calidad de los espermatozoides durante su conservación, podemos concluir que la yema de huevo en polvo puede sustituir a la yema de huevo fresco en la congelación de semen caprino, ya que, independientemente de la edad del donante, no se observó superioridad alguna en ningún tipo de yema de huevo analizadas, aunque permaneciendo la necesidad de eliminar el plasma seminal cuando está presente al 15%. Tampoco la yema de huevo clarificada supuso ninguna mejora, pero sí desventajas a la hora de elaborar los diluyentes. Respecto al uso de la lecitina de soja como crioprotector, ésta podría ser una alternativa viable a incorporar en los medios de refrigeración sin la necesidad de eliminar el plasma seminal. No obstante, tras la crioconservación de espermatozoides lavados y no lavados, en diluyentes a base de LS, la viabilidad espermática fue inferior, observándose una población espermática con membranas intactas pero sin función mitocondrial mayor respecto a los espermatozoides conservados con YHP. En cuanto a la sustitución del crioprotector penetrante y del sistema tampón, el glicerol y el tampón Tris continúan siendo las mejores alternativas en la conservación espermática caprina. La inclusión de BHT como antioxidante en los diluyentes apenas mostró efecto alguno, así como tampoco se observaron diferencias significativas al utilizar diferentes concentraciones de BHT (0.6, 2.0 y 5.0 mM) tras la conservación, tanto en los medios a base de YHP como de LS, aunque en éstos últimos, de nuevo, se observó un notable incremento de espermatozoides con membrana plasmática y acrosomal intactas pero sin función mitocondrial. Finalmente, tras recopilar los resultados obtenidos a lo largo de dos años de experimental, observamos que la viabilidad de los espermatozoides frescos fue superior a los 18 y 30 meses de edad en fotoperiodo positivo (final de la primavera) respecto a los 14 y 25 meses de edad en fotoperiodo negativo (final del otoño). El uso de implantes de melatonina en primavera afectó negativamente la viabilidad y resistencia al shock hipoosmótico del semen fresco y refrigerado, así como la motilidad total en los refrigerados. Por último, existen diferencias entre individuos tanto en el semen fresco como refrigerado y descongelado, identificando tres tipos de individuos: buenos, moderados y malos congeladores.

The main objective of present doctoral thesis was to optimize the semen cryopreservation of goat from Blanca de Rasquera breed. For this, four studies were designed. In the first study we assessed the replacement of fresh egg yolk by powdered egg yolk (PEY), to reduce the risk of microbiological contamination of extender, and the effect of the clarified fresh egg yolk obtained by centrifugation. Simultaneously, we also assessed the effect of the presence of seminal plasma on sperm freezability from males of one and two years old. In the second study, the aim was to substitute the penetrating cryoprotectants (glycerol vs trehalosa) and non-penetrating (PEY vs soybean lecithin (SL)), and the inclusion of the antioxidant BHT and Test zwitterionic-buffer, instead of Tris, in the extenders. The aims of third study were to determine whether SL-based media is a viable alternative in the preservation of goat sperm in the presence of seminal plasma and to determine the optimal concentration of the antioxidant BHT in PEY or SL-based media. Finally, the fourth study was conducted to assess sperm quality throughout the year, the addition of antioxidants (BHT or melatonin) in the extenders, and the application of melatonin implants in males in spring. In addition, we assessed the effect of donor age and the individual in the freezability of goat sperm.

After a complex analysis of sperm quality during preservation, we can conclude that the PEY can be used in place of fresh egg yolk in the extenders for cryopreservation goat semen, since, regardless of donor age, there was not superiority in any of the egg yolk types, remaining the need to remove seminal plasma when the medium containing 15% egg yolk. The use of clarified egg yolk did not confer any benefit to the fresh egg yolk, complicated the process of drawing up preservation media. Regarding the use of SL as a cryoprotectant, this could be a viable alternative to incorporate in preservation at 5°C media, without the need to remove seminal plasma. However, after cryopreservation of washed and unwashed sperm, in LS-based media, sperm viability was low and the population of sperm with intact plasma and acrosomal membranes, but without mitochondrial function was high compared with sperm preserved PEY. Related to the replacement of penetrating cryoprotectant and the buffer, Tris-buffer system and glycerol were still the best alternative in preserving goat sperm. The inclusion of BHT as an antioxidant in extenders showed hardly any effect, nor when using different concentrations of BHT (0.6, 2.0 and 5.0 mM) after preservation, in PEY or SL-based media, although in the latter, again were observed a significant increase of spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes, but without mitochondrial function. Finally, after compiling the results throughout two years of experimental period, we observed that the viability and resistance to hypoosmotic shock of fresh spermatozoa was higher at 18 and 30 months old males during positive photoperiod (late spring) compared to the 14 and 25 months old males during negative photoperiod (late autumn). The use of melatonin implants in spring negatively affected the viability and hypoosmotic shock resistance of fresh and cooled semen, and the total motility in cooled semen. Finally, individual effect exists on buck sperm cryopreservation, identifying 3 types of males: good, average and bad freezers.