Modeling bioreactors for the production of recombinant proteins in high-­‐cell density cultures of Escherichia coli

dc.contributor
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química
dc.contributor.author
Calleja Martínez, Daniel
dc.date.accessioned
2015-01-16T09:02:12Z
dc.date.available
2015-01-16T09:02:12Z
dc.date.issued
2014-11-14
dc.identifier.isbn
9788449049088
cat
dc.identifier.uri
http://hdl.handle.net/10803/285076
dc.description.abstract
Aquest treball està centrat en l’estudi de la producció de proteïnes recombinants en cultius semi-­‐continus d’alta densitat cel·∙lular utilitzant E.coli. Particularment, l’objectiu és el desenvolupament d’un model que sigui capaç de predir l’evolució amb el temps de la producció de l’Aldolasa Ramnulosa-­‐1-­‐Fosfat (RhuA). Primer, s’ha dut a terme un estudi a nivell qualitatiu i quantitatiu de les variables que juguen un paper fonamental en la producció de proteïna. Aquest estudi ha permès l’avaluació de l’impacte en la producció de proteïna (tant en unitats de massa com activitat) de les principals variables experimentals (la concentració d’inductor i biomassa en el moment d’inducció i la velocitat específica de creixement). La Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) permet la determinació de les condicions òptimes de cultiu per tal de maximitzar la producció, a la vegada que permet la determinació de les condicions de treball més adequades. Segon, s’ha desenvolupat, calibrat i validat un model de transport d’IPTG des del medi de cultiu a l’interior cel·∙lular. Aquest model aportarà un estudi més profund del sistema d’inducció. Està dividit en dues etapes: a) amb la utilització d’una soca deficient en lactosa permeases (les proteïnes responsables del transport específic de lactosa -­‐i IPTG) s’han pogut determinar els mecanismes de transport no específics; b) la contribució al transport de les proteïnes específiques s’ha afegit als mecanismes no específics. S’ha demostrat que el model és capaç de predir, no només l’evolució de la concentració d’inductor per a la soca model, sinó que ho és també per a tres soques diferents. Tercer, s’ha presentat un model acoblat (partint de tres diferents models: creixement cel·∙lular, transport d’IPTG i producció de proteïna). El model de producció de proteïna usa com a variables d’entrada les evolucions temporals de les variables dels altres dos models. La velocitat de producció de proteïna es pot relacionar amb la quantitat d’inductor unit al repressor. L’equilibri d’unió depèn de la concentració intracel·∙lular d’inductor, que és calculada mitjançant el model de transport d’IPTG. Per altra banda, el model de creixement cel·∙lular és capaç de predir l’evolució amb el temps de la concentració de biomassa i de volum total en el bioreactor, des del principi de l’etapa discontinua. Per últim, el model de producció de proteïna, juntament amb el de transport d’inductor, es pot estendre a la producció d’altres proteïnes recombinants (Fructosa-­‐6-­‐ Fosfat Aldolasa i ω-­‐Transaminasa, usant diferents sistemes d’expressió. Per a fer-­‐ho, és necessari identificar els paràmetres que son dependents del sistema d’expressió i estimar-­‐ne els valors. S’ha comprovat que el model és capaç de predir, acceptablement, l’evolució amb el temps de la producció de les noves proteïnes. En resum, aquest treball aporta un nou model que contribueix a la predicció de la producció de proteïnes recombinants usant diferents sistemes d’expressió en E.coli.
cat
dc.description.abstract
The present work is focused on the study of recombinant protein production in high-­‐ cell density fed-­‐batch cultures of E.coli. In particular, the development of a model capable to predict Rhamnulose-­‐1-­‐Phosphate Aldolase (RhuA) production is the objective. Firstly, a qualitative and quantitative study about the variables involved in protein production has been made. This study has permitted the evaluation of the impact of the main experimental variables (inducer and biomass concentration at induction and the specific growth rate) on protein production (in mass and activity units). Using a Response Surface Methodology (RSM), that is a statistical methodology, it can be determined the optimal experimental conditions that conduce to a maximum in protein production, and set the operating working conditions. Secondly, because a deeper study about the importance of IPTG in inducible E.coli systems is needed, a model describing inducer uptake has been developed, calibrated and validated. IPTG uptake model has been developed in two steps: a) using a lacY deficient strain, non-­‐specific transport mechanisms have been modeled; b) in addition to non-­‐specific transport mechanisms, lactose permeases (specific transporting proteins for lactose –and IPTG) contribution has been added. It has been demonstrated that the model is capable to predict IPTG depletion from culture medium, not only for the model strain, but also for three different strains. Thirdly, a coupled model, composed by three different ones (biomass growth, IPTG uptake and protein production) has been proposed. In this case, a new protein production model has been presented, using as inputs the time evolution of the variables involved in the other two models. Protein production rate (expressed in mass) can be related to the amount of inducer bound to the repressor. The binding equilibrium depends on the intracellular concentration of IPTG along time, which is an output of the IPTG uptake model. Otherwise, biomass growth model is able to predict biomass concentration and the total volume into the bioreactor from the beginning of the batch phase. Finally, the protein production model, coupled with the IPTG uptake model, has been extended to the production of different proteins (Fructose-­‐6-­‐Phosphate Aldolase and ω-­‐Transaminase) using different expression systems. In this case, the expression system’s dependent parameters have been identified, and the model has demonstrated that, estimating those parameters is also capable to predict, properly, the protein production along time. To sum up, this work presents a new model, which contributes to the prediction of protein production in different inducible E.coli expression systems.
eng
dc.format.extent
171 p.
cat
dc.format.mimetype
application/pdf
dc.language.iso
eng
cat
dc.publisher
Universitat Autònoma de Barcelona
dc.rights.license
L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/
dc.rights.uri
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/
*
dc.source
TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
dc.subject
Modelització
cat
dc.subject
Modeling
cat
dc.subject
Modelización
cat
dc.subject
Fed-batch
cat
dc.subject
Escherichia coli
cat
dc.subject.other
Tecnologies
cat
dc.title
Modeling bioreactors for the production of recombinant proteins in high-­‐cell density cultures of Escherichia coli
cat
dc.type
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.type
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.subject.udc
663/664
cat
dc.contributor.authoremail
daniel.calleja@uab.cat
cat
dc.contributor.director
López Santín, Josep
dc.contributor.director
de Mas Rocabayera, Carles
dc.embargo.terms
cap
cat
dc.rights.accessLevel
info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.identifier.dl
B-3045-2015


Documents

dcm1de1.pdf

3.964Mb PDF

Aquest element apareix en la col·lecció o col·leccions següent(s)