Friends or foes in virus-host interactions: Cell regulation of HIV-1 replication

Author

Ruiz de Andrés, Alba

Director

Esté Araque, José A.

Farrés i Vicén, Jaume

Date of defense

2014-12-05

ISBN

9788449049477

Legal Deposit

B-3123-2015

Pages

152 p.



Department/Institute

Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Abstract

El VIH és un patogen intracel·lular obligat i per tant està totalment subjecte als recursos intracel·lulars disponibles. El tractament antiretroviral actual suprimeix la replicació viral però no evita la persistència i la proliferació de les cèl·lules infectades de forma latent, posant en evidència la necessitat de desenvolupar noves estratègies que aconsegueixin eliminar de forma definitiva el virus. El descobriment de nous factors cel·lulars del VIH pot aportar noves dianes per al desenvolupament d’aquestes estratègies. Diversos estudis de cribatge i d’identificació de gens han identificat un número molt elevat de factors cel·lulars del VIH. Per poder traslladar el coneixement científic a la clínica cal un estudi més acurat que defineixi els mecanismes funcionals i la regulació de cadascun d’aquests factors. Partint de l’estudi sobre la dependència del VIH al complex proteic Mediator (MED) i per altra banda de la restricció del VIH mitjançada pel factor antiviral SAMHD1, en aquesta tesi demostro com en les interaccions virus-hoste sovint hi ha un comú denominador en quant a la seva implicació en el metabolisme cel·lular. Aquest tret comú suggereix que els factors cel·lulars del VIH, tot i que en la seva relació estreta amb el virus el potenciïn o l’inhibeixin, alhora sempre són modulats per mecanismes complexes associats a la regulació cel·lular que finalment són els què governen la replicació viral. S’inclou una avaluació de l’activitat MED sobre la replicació del VIH amb la identificació de 9 sobre 28 proteïnes del complex MED que de forma significativa afecten la replicació del VIH, sempre en una etapa posterior a la integració. D’entre les subunitats MED identificades algunes tenen un rol predominant en la transcripció de gens virals inicials i d’altres en la generació de transcrits virals més tardans, però totes comprometen la transcripció del VIH que és induïda per la proteïna viral Tat. Els assaigs de coimmunoprecipitació, a més, han suggerit que aquesta dependència passa per una interacció física entre MED i Tat. D’entre l’ampli grup de proteïnes cel·lulars que modulen el VIH, només algunes inhibeixen el virus. SAMHD1 ho aconsegueix bloquejant l’enzim del VIH transcriptasa inversa. La seva regulació sobre els nivells de dNTPs intracel·lulars s’investiga al llarg del segon capítol. L’activitat de SAMHD1 influencia la potència dels inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs a nucleòtids, de manera que una reducció intracel·lular dels nivells de SAMHD1 porta a una disminució significativa de la sensibilitat del VIH enfront els inhibidors anàlegs a Timidina. Un estudi molecular més extens ha permès identificar que en els limfòcits T CD4+ proliferants i en els macròfags s’expressa una forma fosforilada de SAMHD1 que correspon amb la susceptibilitat a la infecció. Específicament s’ha identificat CDK6 i ciclina D3 com un complex regulador de CDK2, que alhora controlaria la progressió a cicle cel·lular i la fosforilació de SAMHD1 per tal d’inactivar-lo en cèl·lules T i en macròfags, fent-los susceptibles a la infecció. La inhibició de CDKN1A (ó p21) porta a un alleujament en la restricció de VIH modulada per SAMHD1, generant més replicació viral. L’inhibidor de CDK6 palbociclib confirma la via de senyalització proposada ja que bloqueja efectivament la fosforilació de SAMHD1, els nivells intracel·lulars de dNTP, la transcripció inversa i l’activació de CDK2. En els propers anys l’estudi acurat del factors cel·lulars del VIH-1 permetrà el desenvolupament d’estratègies terapèutiques “anti-VIH” basades en fer diana a l’hoste més que en el virus, donant noves propostes que facin front a les limitacions del tractament antiretroviral.


HIV is an obligate intracellular pathogen and its replication is entirely reliant on intracellular resources, depending on its capacity of recruitment and utilization of a wide array of host proteins to complete the viral life cycle. Current antiretroviral treatments generally suppress viral replication but do not avoid persistence and proliferation of latently infected cells over time, thus not curing HIV/AIDS and evidencing the need to develop new strategies that may finally converge in eliminating the virus. The discovery of human cellular factors could provide new targets for the development of these strategies. Previous siRNA-based screenings and whole-genome studies published a high amount of alleged HIV-1 host factors but their functional mechanisms need to be addressed to translate scientific knowledge into the clinic. By studying both the HIV dependency on a protein complex from the cellular transcriptional machinery called Mediator (MED) and the HIV restriction mediated by the antiviral factor SAMHD1 whose mechanism of regulation is still under debate, I show how viral-host interactions usually converge in their implication on cell metabolism, suggesting that identified host factors that either enhance or inhibit HIV-1 are in turn modulated by cell regulation-associated mechanisms that finally govern viral replication. Concretely, we provide an evaluation of the MED complex activity on HIV replication identifying nine out of 28 human MED proteins significantly affecting HIV replication, all pointing at a post-integration step. Moreover, the identified MED proteins modulating the generation of new viral transcripts were differentially affecting early or late stages of HIV-1 transcription, apart from compromising particularly the HIV transcription induced by the HIV-1 protein Tat. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments also suggested physical interaction between MED and Tat. Among the high number of cellular proteins modulating HIV, only a few actively inhibit viral replication. SAMHD1 achieves it by blocking the viral reverse transcriptase. Here, the regulation modulating the intracellular dNTP levels is investigated. The influence of SAMHD1 activity on nucleoside reverse transcriptase inhibitors was demonstrated, showing that a reduction of SAMHD1 levels significantly decreased HIV sensitivity solely on thymidine-analogue inhibitors. Proliferating primary CD4+ T cells or macrophages were then observed to express a phosphorylated form of SAMHD1 that corresponded with susceptibility to infection in cell culture and that was not present in non-cycling cells. Identified phosphorylation sites in cycling cells are mainly driven by cyclin-dependent kinases (CDK). In fact, we identified CDK6 and cyclin D3 as an upstream regulator of CDK2 induces SAMHD1 phosphorylation in primary T cells and macrophages. CDK2 is strongly linked to cell cycle progression and coordinates SAMHD1 phosphorylation and inactivation. Knockdown of the cellular CDK2 inhibitor CDKN1A (p21) led to a relief of the SAMHD1 restriction, increasing virus replication. The CDK6 inhibitor palbociclib blocked SAMHD1 phosphorylation, intracellular dNTP levels, HIV-1 reverse transcription and reduced CDK2 activation and its antiviral activity was lost when SAMHD1 was degraded by Vpx. Altogether, our results reinforce the idea that in the following years the deeper study of HIV-1 cellular factors will probably raise the possibility of a new class of “anti-HIV” therapeutics targeting the host rather than the virus, collectively giving new proposals to the unresolved challenge of curing HIV infection and AIDS.

Keywords

VIH; HIV; Cofactors; Cofactor; Restricció viral; Viral restriction

Subjects

577 - Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Knowledge Area

Ciències Experimentals

Documents

arda1de1.pdf

1.750Mb

 

Rights

L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/
L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/

This item appears in the following Collection(s)