Two-dimensional engineering of molecular nanoparticles for biological applications

Abstract

El trabajo realizado en esta tesis se ha centrado en dos sistemas de nanopartículas moleculares que tienen un uso potencial en el campo de la nanomedicina: i) vesículas lipídicas – entidades supramoleculares que se proponen como sistemas de liberación de fármacos y ii) cuerpos de inclusión (Inclusion Bodies, IBs) – nanopartículas formadas por agregados proteicos. La primiera parte del trabajo se ha centrado en el estudio comparativo de sistemas vesiculares preparados por i) diferentes metodologías así como ii) diferentes composiciones. Los métodos comparados son DELOS-susp, un método de una sola etapa basado en fluidos comprimidos y procesos convencionales que constan de varias etapas, como hidratación de película delgada (thin film hydration, TFH) y tratamiento con ultrasonidos seguido de extrusión (ultrasound, US). La influencia de la estructura interna se ha investigado con vesículas con diferentes composiciones mixtas: CTAB-Colesterol y DOPC-Colesterol. Para este estudio hemos utilizado métodos que monitorizan la interacción de nanomaterials con superficies como la resonancia de plasmones superficiales (surface plasmon resonance, SPR) y la microbalanza de cristal de cuarzo con disipación (quartz crystal microbalance with dissipation, QCM-D). A partir del análisis de datos hemos demostrado que todos los sistemas investigados forman monocapas de vesículas enteras tras la interacción con superficies de oro. Ha sido posible calcular la absorción de masa, espesor, densidad y propiedades mecánicas de los diferentes sistemas vesiculares estudiados. Hemos concluido, que la influencia del método de preparación es muy. Es decir, en este tipo de sistemas, la arquitectura interna, una vez lograda, es la que determina las propiedades mecánicas de las entidades supramoleculares. Por otro lado, se ha encontrado una influencia de la composición interna de las vesículas en sus propiedades mecánicas. Así, las vesículas formadas por colesterol y CTAB han demostrado ser más rígidas que las formadas por colesterol y DOPC. Por otro lado, esta tesis se ha centrado en el uso de IBs para la funcionalización de superficies con diferentes patrones utilizando técnicas de litografía blanda. Posteriormente, se han caracterizado y evaluado las propiedades de estas superficies decoradas con IBs como soportes para el cultivo y guiaje de células. En el marco de esta tesis se han conseguido preparar con éxito patrones geométricos de IBs de alta resolución. Un análisis estadístico de los datos obtenidos a partir de imágenes de microscopía óptica y confocal ha permitido sacar demostrar, que la orientación, la morfología, y el posicionamiento de las células dependen de la geometría de los patrones. La siguiente etapa de la tesis estuvo centrada en la desarrollo de un dispositivo que permitiera la deposición de gradientes de IBs en superficies a partir de suspensiones coloidales. La técnica está basada en el fenómeno ampliamente conocido del “efecto de la gota de café”. Así, un dispositivo ha sido diseñado, construido, calibrado y utilizado con éxito para preparar sustratos funcionalizados con patrones, muy fáciles de modificar y con bajo coste. Con este dispositivo se ha propuesto e implementado un protocolo de la deposición de gradientes de nanopartículas. Los gradientes obtenidos se han caracterizado en cada caso confirmando la presencia de cambios lineales de concentración de IB sobre grandes áreas (ca 500 micras) tal y como se necesita para realizar estudios de motilidad celular. En la última parte de la tesis hemos utilizado los gradientes de IBs para estudiar la motilidad celular. El método de deposición permitió preparación de sustrato complejo con más de 80 diferentes entornos para el cultivo celular. Como conclusión general de esta parte podemos confirmar que existe un control claro de la motilidad celular provocada por los patrones de gradientes de IBs ingeniados. En general, con el trabajo realizado hemos demostrado que los IBs pueden considerarse una nueva herramienta muy interesante y útil para el guiaje celular, lo cual puede tener implicaciones muy interesantes en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos.

This Thesis is focused on two systems of molecular nanoparticles that have a prospective use in nanomedicine. These systems are: (i) lipidic vesicles – supramolecular entities that are already used as drug delivery systems and (ii) Inclusion Bodies (IBs) - proteic nanoaggregates, that are emerging as a new tool in the light of tissue engineering The first part of this work is focused on the comparison of a vesicular system prepared by DELOS ‐ susp, a compressed fluid‐based single-step method previously developed in our group, and conventional multi‐step processes that are usually employed for vesicle production, like thin film hydratation or sonication followed by extrusion. We have compared also two different vesicle compositions: one system is based on DOPC phospholipid and cholesterol (liposome) and the other contain a quaternary ammonia amphiphile, CTAB, and cholesterol (quatsomes). To study the structural characteristics of both systems we have used the combination of two non-labelling methods: Surface Plasmon Resonance (SPR) and Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (QCM-D) in order to obtain complementary data. We conclude that both investigated vesicular systems form layers of vesicles when interacting with gold surfaces. We have calculated the mass uptake, thickness, density and mechanical properties of the studied vesicular systems. We conclude, that the influence of the preparation method is negligible in the case of quatsomes. That is, the internal architecture, once achieved, determines the mechanical properties of these supramolecular entities. On the other hand, vesicles formed by quaternary salts and cholesterol have demonstrated to be more rigid than the liposomes based on phospholipid and cholesterol. The work developed in following three Chapters has been focused on the use IBs for surface engineering. In this part we have characterized and evaluated IBs decorated surfaces as supports for cell cultivation and guidance. The second Chapter is centred on the formation of two-dimensional microscale patterns of IBs using a soft lithography technique and evaluation of cell behaviour when cultivated on them. We have successfully prepared high resolution geometrical IBs patterns and cultivated cell on them. Basing on a deep, statistical analysis of data derived from optical and confocal microscopy images we derived conclusions about the influence of the IBs pattern geometry on cell´s behaviour. The orientation, morphology and positioning of cells clearly depends on the geometry of IBs patterns proving the usefulness of IBs for cell guidance. Moreover, the synergy between biological activity and topographical stimuli of cells by IBs has been confirmed. In the third Chapter, in order to study cell motility induced by IBs, we have focused on the design and engineering of a device allowing deposition of surface-bound IBs gradients from colloidal suspensions. The developed technique is based on the widely known coffee drop effect. A deposition device was constructed, calibrated and successfully used to prepare substrates with the desired patterns, which can be obtained in a fast (up to 1 mm per 1 min) and cost-effective manner. Also, a robust protocol for gradient deposition was proposed and implemented. The obtained gradients were characterized, confirming the presence of linear changes of IBs concentration over broad areas (c.a. 500 μm) as needed to perform cell motility studies. The last Chapter describes the use of the IBs gradients to study cell motility. A complex substrate with 80 different zones for high-throughput cell culture study was successfully produced. Individual cell movement assay were carried out using confocal microscopy time-lapse acquisition. Cell movement descriptors such as average travelled distance, directionality, etc. were quantified, enabling us to investigate in detail how factors such as the gradient slope or the concentration of IBs influence cell motility. As an overall conclusion of this part we can confirm the control over cell motility by the IBs gradient patterns. In general we have proved that IBs as well as the different two-dimensional engineering methods used are interesting and useful approaches with a prospective use in the control of cell guidance as well as a promising tools in regenerative medicine and tissue engineering.