New insights into the MAPK function in meiotic progression and the regulation of osmostress-induced apoptosis in Xenopus oocytes

Abstract

En el organismo modelo Xenopus laevis, los oocitos de estadio VI están parados indefinidamente en la profase (G2/M) de la meiosis I hasta que se produce una adecuada estimulación hormonal. Una red de regulación positiva alrededor de la cascada Mos/MEK/ERK asegura la maduración (GVBD) de los oocitos tras la estimulación con progesterona. Sin embargo, el papel de las MAPK de estrés JNK y p38 en la progresión meiótica no es tan claro. Aquí analizamos una proteína de 42 kDa detectada con anticuerpos pJNK (XpJNK-p42) que aparece alrededor del GVBD en oocitos tratados con progesterona. La expresión ectópica de MEKK1 constitutivamente activo acelera la maduración de los oocitos mediante la activación de las vías de señalización de p38 y ERK, pero no de la cascada JNK. Por otra parte, cuatro transcritos diferentes de JNK3 presentes en los oocitos no sintetizan proteína y no se activan durante la maduración inducida por progesterona. El análisis de espectrometría de masas indica que XpJNK-p42 es en realidad ERK2 fosforilado. Curiosamente, el anticuerpo pJNK sólo reconoce pERK2 en oocitos maduros pero no en oocitos expuestos al shock hiperosmótico, lo que sugiere que una modificación post-traduccional de pERK2 tiene lugar durante la progresión meiótica. Es importante destacar que ni la sobreexpresión de ERK2 ni el inhibidor de JNK SP600125 afectan a la fosforilación de c-Jun utilizando extractos de oocitos maduros. En conclusión, las proteínas JNK no están involucradas en la maduración de los oocitos de Xenopus, y la fosforilación de c-Jun detectada en oocitos maduros es independiente de JNK y ERK2. Hemos descrito previamente que el shock hiperosmótico induce apoptosis en oocitos de Xenopus mediante la activación de cuatro vías independientes: p38, JNK, calpainas y liberación de Smac/DIABLO. También hemos descrito que la activación de p38, JNK1-1 y JNK1-2 es claramente pro-apoptótica. Sin embargo, varias horas después del shock hiperosmótico la isoforma JNK1-2 desaparece, sugiriendo algún tipo de degradación. Además, los estudios anteriores no consideraron el papel de los miembros de la familia de Bcl-2 en la apoptosis inducida por estrés osmótico. Aquí mostramos que pJNK1-2 es proteolizada en Asp385 por caspasa-3, y que la proteína resultante acelera la liberación del citocromo c y la activación de caspasa-3, creando así un bucle de retroalimentación positiva. También mostramos que la sobreexpresión de Bcl-xL en oocitos de Xenopus protege a estos de la apoptosis inducida por shock hiperosmótico. Los oocitos que expresan Bid en combinación con Bcl-xL, presentan tres formas distintas de Bid: no ubiquitinada, mono- y biubiquitinada. Todas las formas de Bid se localizan en el citosol y la mitocondria. El shock hiperosmótico incrementa ligeramente, y de forma rápida, las formas mono- y biubiquitinadas de Bid en la mitocondria. Posteriormente, una pequeña parte de Bid es proteolizada en Asp52, probablemente por una caspasa iniciadora, generando un fragmento N-terminal (nBid) y un fragmento C-terminal altamente pro-apoptótico (tBid). Cuando el citocromo c es liberado y se activa la caspasa-3 se produce una proteólisis masiva de Bid (formas no ubiquitinada y monoubiquitinada) en Asp52, mediada por caspasa-3, creando así otro bucle de retroalimentación positiva. Aunque algunos experimentos sugieren que la forma no ubiquitinada de Bid se proteoliza más rápido y es más pro-apoptótica que las otras formas, los efectos funcionales de la ubiquitinación en la regulación de la apoptosis no son tan claros. Sin embargo, la función pro-apoptótica de Bid se atenúa notablemente en el mutante Bid-D52N, que no puede ser proteolizado por caspasas. En conclusión, la activación de caspasa-3 inducida por shock hiperosmótico pone en marcha dos bucles de retroalimentación positiva mediante la proteólisis de JNK1-2 y Bid, promoviendo así la muerte irreversible de los oocitos.

In the model organism Xenopus laevis, oocytes at stage VI are standing in prophase (G2/M) of meiosis I indefinitely until proper hormone stimulation. A positive regulation network around the Mos/MEK/ERK cascade ensures the rapid maturation (GVBD) of the oocytes upon stimulation with progesterone. However, for the stress associated MAPK families, JNK and p38, their involvement in meiotic resumption is not so clear. Here we analyze a protein of 42 kDa detected by pJNK antibodies (XpJNK-p42) that appears around GVBD in progesterone treated oocytes. Ectopic expression of a constitutively active MEKK1 accelerates oocyte maturation through activation of the p38 and ERK signaling pathways, but not the JNK cascade. Moreover, four dormant JNK3 transcripts are described in Xenopus oocytes and none of them are activated during progesterone-induced oocyte maturation. Protein mass spectrometry analysis indicates that XpJNK-p42 is actually phosphorylated ERK2. Intriguingly, the pJNK antibody only recognizes pERK2 in mature oocytes but not in oocytes exposed to hyperosmotic shock, suggesting that a posttranslational modification of pERK2 occurs during meiotic progression. Importantly, neither ERK2 overexpression nor JNK inhibitor SP600125 affects c-Jun phosphorylation detected in mature oocytes extracts. In conclusion, JNK proteins are not involved in Xenopus oocyte maturation, and the phosphorylation of c-Jun detected in mature oocytes is independent of JNK and ERK2.

We previously reported that hyperosmotic shock induces apoptosis in Xenopus oocytes through activation of four independent pathways: p38, JNK, calpains and Smac/DIABLO release. We also reported that activation of p38β, JNK1-1, and JNK1-2 is clearly pro-apoptotic. However, several hours after hyperosmotic shock the JNK1-2 isoform disappears, suggesting some type of degradation during cell death. In addition, our previous studies did not address the role of the Bcl-2 family members in the regulation of cytochrome c release. Here we show that Xenopus pJNK1-2 is proteolyzed at Asp385 by caspase-3, and the resulting cleaved protein accelerates cytochrome c release and caspase-3 activation, thus creating a positive feedback loop. We also show that overexpression of Bcl-xL in Xenopus oocytes protect from osmostress-induced apoptosis. In oocytes expressing Bid in combination with Bcl-xL, three different types of Bid are detected: non-ubiquitinated Bid, mono- and bi-ubiquitinated Bid. All Bid types reside both in the cytosol and the mitochondria. Hyperosmotic shock rapidly induces a slight increase of mono- and bi-ubiquitinated Bid in the mitochondria. Subsequently, Bid is cleaved at Asp52 at very low levels, probably by an initiator caspase, generating an N-terminal fragment (nBid) and a highly pro-apoptotic C-terminal fragment (tBid). When cytochrome c is released and caspase-3 is activated a massive proteolysis of non-ubiquitinated and mono-ubiquitinated Bid occurs at Asp52, mediated by caspase-3, thus creating another positive feedback loop. Although some experiments suggest that non-ubiquitinated Bid is proteolyzed faster and is more pro-apoptotic than wild type Bid, the functional effects of Bid ubiquitination are not so clear. However, the pro-apoptotic function of Bid is markedly attenuated in mutant Bid-D52N that is not cleaved by caspases, indicating that Bid proteolysis regulates osmostress-induced apoptosis. In conclusion, caspase-3 activation induced by hyperosmotic shock engages two positive feedback loops through the cleavage of JNK1-2 and Bid, thus promoting an irreversible death of the oocytes.