Genetic architecture of agronomic traits in peach [Prunus persica (L.) Batsch]: subacid, flat shape and nectarine

Abstract

L'objectiu dels programes de millora genètica del préssec és generar varietats adaptats a les condicions agronòmiques locals i satisfer els requeriments del consumidor. Això últim implica millorar la qualitat del fruit. L'estratègia seguida per molts milloradors es basa en la selección de descendents de creuaments on s’espera segregació per a caràcters fenotípics. Es tracta d’un mètode costós tant en temps com en diners a causa del período de juvenilitad del presseguer (2-3 anys) i també als recursos que suposa el mantener les plàntules en el camp durant el procés d’avaluació i selecció. L'objectiu d'aquesta tesi va ser el desenvolupament de marcadors moleculars per a la seva aplicació en la selecció assistida per marcadors (SAM) de tres caràcters del fruit: baixa acidesa, fruit pla i pell glabra. En els dos primers capítols estudiem el locus del carácter subàcido (D) i el fruit pla (S) i hem realitzat l’anàlisis d’associació en les seves respectives regions genòmiques. Per a ambdós caràcters s'han generat i validat marcadors moleculars (SSRs i SNPs) que poden ser directament aplicats a SAM. L'estudi de l’haplotipus subàcid ens va permetre identificar diversos gens candidats. Aquestes resultats ens suggereix l'existència d'un únic origen de l’al·lel subàcido. L'anàlisi del locus S ens va permetre identificar dues INDELs altament associats amb el fruit pla. Aquests polimorfismes es van observar en regió codificant del gen ppa025511m, concretament en el segon exò del gen. Aquesta associació va ser avaluada en un ampli panell de varietats i en una població obtinguda a partir del creuament de dues parentals de fruits plans. L'anàlisi de la seqüència completa d'aquest gen va permetre la identificació de la supressió d'un fragment de 9Kb que afecta la regió 5’UTR del gen així com al primer exò, a l’intró i a una petita part del segon exò. La funció d'aquest gen va ser validada en un mutant tipus “sport” generat espontàneament en un arbre de la varietat plana ‘UFO4’. Es tracta d'un mutante quimèric mb una mutació que només afecta a les cèl·lules de la segona capa meristemàtica (LII), que genera la polpa del fruit. L'amplificació per PCR de l’INDEL d'aquest gen en la polpa del mutant rodó va revelar un canvi a l’al·lel pla. Malgrat que l‘alelo pla és dominant, els fruits plans han de presentar-lo en hetericigosis per a ser viables. Aquest fet amb la reversió a la forma rodona del mutant d’UFO4 suggereixen que aquest al·lel pot actuar com dominant negatiu. En el tercer capítol seqüenciem el genoma de 5 varietats de préssec i els seus respectius mutantes nectarina. Es van a estimar la variabilitat somática i la mutació causal de la pell glabra. La metodología empleada per al processament de les lectures i la identificació dels petis polimorfismes va generar un excés de falsos polimorfismes, possiblement causats per alineaments erronis de les seqüències repetitives del genoma. Mitjançant l'ús d'un filtrat més restrictiu es va reduir aquest valor. Els valors de diversitat nucleotídica i d’heterozigositat van ser similars als observats per Aranzana et al., (2012) i Verd et al., (2013). L’analisi del locus G va mostrar una menor π i una major Ho. Sota dues possibles hipótesis per a l’estudi l’al·lel causal del caràcter nectarina vam identificar diversos gens candidats amb funcions relacionades amb el desenvolupament de la paret cel·lular. No obstant això cap d'ells va resultar ser PpeMYB25 on recentment s’ha descrit una inserció de 7Kb asssociada al carácter nectarina (Vendramin et al., 2014). La insuficient cobertura de seqüenciació en la regió genómica del locus G pot haver estat la causa de la no identificació d’aquest polimorfisme en les nostres seqüències.

The aim of current breeding programs is to provide new fruit varieties adapted to the local agronomic conditions and to satisfy the requirements of the consumers. This last fact implies to improve the fruit quality. The strategy followed by most breeding programs is based on performing controlled crosses to select those individuals showing the target traits. Although this approach has succeed in the production of most of the varieties available today, it is time consuming and costly due the time required to obtain fruits (2-3 years) and the resources needed to keep the seedlings in the field during the evaluation and selection processes. The objective of this thesis was to develop molecular markers useful in marker assisted selection (MAS) for three important agronomical traits in peach fruits: low acidity, flat shape and glabrous skin (nectarine trait). In the first two chapters of this document we have used region-based association analysis to study the architecture of the locus responsible for either sub-acid (D) and flat fruits (S). In both cases the study has provided markers (SSR and SNPs) ready to be applied for MAS in peach breeding programs. The study of the length of the sub-acid haplotype, which is maintained more than 24Kbp long, allowed to hypothesize about a unique origin of this trait and to identify candidate genes. Similarly, the analysis of the S locus allowed the identification of two linked INDELs in the second exon of the gene ppa025511m highly associated with the flat shape of the fruit. The association was tested in a broad panel of varieties and in the offspring of a crossing population between two flat peaches. The sequencing analysis of the whole gene allowed the identification of a big deletion, of about 9Kbp, affecting its 5’ UTR, its first exon and its intron. The function of the gene was validated in a round sport mutant from a flat peach (UFO-4). This mutant was chimeric; the mutation only affected cells of the second layer (LII) of the meristerm, which generates the flesh of the fruit. A PCR amplification of the gene and the use of specific primers for the INDEL revealed a mutation in the flat allele in the flesh of the chimeric mutant, which produced the reversion to the round shape. The obligated heterozygosis of the flat allele and the reversion to the wild shape suggest a dominant negative (DN) mechanism. In the third chapter we sequenced the whole genome of 5 peach varieties and 6 sport nectarines derived from them. We estimated the overall somatic variability and studied the causal mutation from hairy fruit to glabrous. The reads processing and SNP calling revealed an excess of false variants that was especially evident in the analysis of the sport mutants. One of the main causes for the false variants was the misalignments of repetitive regions. The use of more restrictive SNP calling filters reduced the excess of false variants. The nucleotide diversity and heterozygosity of the varieties was similar to the one reported for peach (Aranzana et al., 2012; Verde et al., 2013). The analysis of the variations in the G locus region showed lower and higher Ho. To look for the causal allele for the nectarine trait we postulated two possible causes for the new mutation. These data provided several candidate genes involved in the cell wall development, however none of them was the gene PpeMYB25, where a big insertion of 7Kb in its second exon has recently been described as linked with the trait (Vendramin et al., 2014). This was probably due to an insufficient sequencing coverage in this genomic region.