Búsqueda de Biomarcadores asociados a la conversión a esclerosis múltiple en pacientes con síndromes clínicos aislados

Abstract

Aproximadamente el 85% de los pacientes con esclerosis múltiple (EM) inician la enfermedad con un síndrome clínico aislado (CIS), pero se ha descrito que entre un 30 y un 85% de los pacientes que presentan un CIS finalmente desarrollan EM clínicamente definida (EMCD). Actualmente se utilizan la presencia de alteraciones en la resonancia magnética (RM) y la detección de bandas oligoclonales en el líquido cefalorraquídeo (LCR) como marcadores pronósticos en los pacientes con CIS. Aparte de estos factores, la evidencia sobre el posible papel de otros biomarcadores moleculares ha sido controvertida por falta de validación de los resultados. Con este objetivo llevamos a cabo la presente tesis doctoral. Mediante un abordaje de proteómica en pooles de muestras de LCR de pacientes con CIS que convertían a EMCD y pacientes que permanecían como CIS se buscaron proteínas asociadas a la conversión a EM. Las proteínas que se encontraron expresadas de forma diferencial se validaron en muestras individuales mediante técnicas alternativas como el ELISA y selected reaction monitoring (SRM). De las proteínas validadas se seleccionó la chitinase 3-like 1 (CHI3L1) para su validación en una cohorte independiente y numerosa de pacientes con CIS. Además, se determinó su expresión en plasma en las diferentes formas clínicas de la enfermedad y se estudió la asociación entre un polimorfismo en el promotor del gen de la CHI3L1 y la EM. Por otro lado, se estudió la expresión de la CHI3L1 en tejido cerebral de pacientes con EM así como en las poblaciones celulares del LCR. Finalmente, se realizó el modelo animal de la enfermedad, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones knockout (KO) y wild-type (WT) para la CHI3L1 y se realizaron estudios histopatológicos y ensayos de proliferación para determinar la función de la proteína en la respuesta inmune. De las proteínas encontradas en el estudio de proteómica se validaron como biomarcadores asociados a la conversión a EM la CHI3L1, la semaforina 7A y la CNDP1. La CHI3L1 además, se validó en una cohorte numerosa de pacientes con CIS, encontrándose además una correlación entre los niveles de CHI3L1 y el tiempo de conversión y el tiempo hasta alcanzar un EDSS de 3. Por otro lado, los niveles plasmáticos de CHI3L1 se encontraron incrementados en los pacientes con formas progresivas de la enfermedad respecto a los controles sanos y los pacientes con formas recurrentes. Además, se encontró una asociación entre un polimorfismo en el promotor del gen de la CHI3L1 y las formas progresivas de la enfermedad. Cuando se estudió el papel de la proteína en el modelo animal no se observaron diferencias en la gravedad del curso clínico entre los ratones WT y KO para la proteína. Tampoco se encontraron diferencias a nivel histopatológico ni en la respuesta inmune. Con los resultados obtenidos se puede concluir que la CHI3L1, semaforina 7A y CNDP1 se han validado como biomarcadores asociados con la conversión a EMCD, y que los niveles de CHI3L1 en LCR tienen además claras implicaciones pronósticas en los pacientes con CIS. A diferencia del LCR, los niveles de CHI3L1 en plasma no parecen reflejar el grado de inflamación que tiene lugar en le SNC de los pacientes con EM, y se asocian con las formas progresivas de la enfermedad. Finalmente, los estudios realizados en el modelo animal de EM no sugieren un papel inmunoregulador de la CHI3L1, en cuanto a que la eliminación del gen Brp-39 en ratones no se asoció con cambios en el curso clínico de la EAE, cambios histopatológicos, o alteraciones en las respuestas inmunitarias.

In about 85% of patients with multiple sclerosis (MS) the disease starts with a clinically isolated syndrome (CIS), but only 30 to 85% of patients with CIS finally develop clinically definite MS (CDMS). At present, only magnetic resonance (MR) abnormalities and presence of oligoclonal bands (BOC) in the cerebrospinal fluid (CSF) are used as prognostic biomarkers in CIS patients. Apart from these, the role of other molecular biomarkers is still controversial due to lack of validation. This thesis was conducted with the aim to identify and validate additional molecular biomarkers associated with the conversion to MS. A proteomic study with pooled CSF samples from patients with CIS who converted to CDMS and patients who remained as CIS was performed to identify biomarkers associated with conversion to MS. Those proteins that were found differentially expressed between groups were validated in individual samples by means of alternative techniques such as ELISA and selected reaction monitoring (SRM). Among the validated proteins, chitinase 3-like 1 (CHI3L1) was selected for validation in a large cohort of CIS patients. Furthermore, CHI3L1 levels were determined in plasma from patients with different clinical forms and a polymorphism in the promoter region of the CHI3L1 gene was investigated for its potential association with the disease. Additionally, the cell source of CHI3L1 was studied in brain tissue and CSF samples from MS patients. Finally, the animal model of the disease, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in wild-type (WT) and knock-out (KO) mice for the CHI3L1 protein. Histopathological and proliferative response studies were performed to assess the role of the protein in the immune response. Amongst the proteins obtained in the proteomics study only CHI3L1, semaphorin 7A and CDNP1 were validated. Furthermore, CHI3L1 was validated in a large cohort of CIS patients. A correlation between CSF CHI3L1 levels and time to conversion and time to EDSS 3 was also found. On the other hand, plasma levels of CHI3L1 were found increased in patients with progressive forms of MS compared to healthy controls and patients with relapse-onset. Additionally there was an association between the studied polymorphism and the progressive forms of the disease. When the protein role in the disease was studied in EAE no differences were observed in the clinical course between WT and KO mice. Also, no differences were found regarding the histopathology and the immune response. In conclusion the aggregate results confirm CHI3L1, semaphorin 7A and CNDP1 as biomarkers associated with conversion to CDMS in CIS patients, and CHI3L1 CSF levels also have clear prognostic implications in CIS patients. In contrast to CSF, plasma levels of CHI3L1 are not reflecting the inflammation degree in the CNS in patients with MS, and are associated with the progressive forms of the disease. Finally, the studies performed in the animal model of MS do not suggest an immunoregulatory role of CHI3L1, since the elimination of the Brp-39 gene is not associated with changes in the clinical course, histopathology or immune response.