Development of artificial viruses for nanomedicine and gene therapy

Abstract

La convergencia de diversas disciplinas como la biotecnología, biología molecular e ingeniería genética en el desarrollo de vehículos terapéuticos a escala nanometrica para la entrega de moléculas terapeuticas, se plantea como una herramienta con un elevado potencial en el campo de la nanomedicina. El mayor reto de estos nanovehiculos es permitir una eficaz entrega de ácidos nucleicos, proteínas o incluso fármacos, con una elevada especificidad celular para poder así disminuir la dosis administrada y por eso reducir sus toxicidad. En el caso de los ácidos nucleicos, la especificidad de entrega y la protección de los mismos de las nucleasas son los puntos clave para prever el desarrollo de estos sistemas. Sin embargo, el uso de vectores virales que parecían contener todos los elementos necesarios para aplicar la terapia génica extensivamente, ha topado con serios problemas de toxicidad e inmunogenicidad que limitan su uso. Así pues, el desarrollo de vectores de entrega no víricos, degradables y de diverso origen como dendrímeros, liposomas, polímeros, proteínas modulares o virus-like particles (VLPs), entre otros, se ha revelado como un campo de investigación que promete aportar las herramientas necesarias para desarrollar vehículos auto ensamblables “inteligentes” capaces de superar las barreras impuestas por el sistema biológico y llegar al tejido o compartimiento celular diana sin provocar las reacciones adversas que limitan el utilizo de sistemas virales. En el óptica de estudiar la optimización de nanovehiculos autoensamblabels de origen proteicos para la terapia génica, hemos explorado por un lado la caracterización de VLPs obtenidas mediante la expresión del la proteína VP1 de la capside viral del human JC virus tanto en E.coli, como en células de insecto. Por otro lado hemos estudiado la optimización del proceso de producción y autoensamblado de proteínas multifuncionales y evaluado su capacidad de unir y proteger los acidos nucleicos de la degradación por parte de proteasas. Así pues, diferentes entornos genéticos del sistema de control de calidad en E. coli han evidenciado la alteración del rendimiento de producción y de calidad conformacional en el ensamblado de las VLPs del virus JC. En este tesis hemos explorado los efectos de la chaperona DnaK en la producción y calidad conformacional de las VLPs formadas por la proteína VP1 a través de tres cepas caracterizadas por la presencia/ausencia/sobre expresión de la chaperona DnaK. Se ha observado que la ausencia de esta chaperona promueve una mayor rendimiento de producción pero al mismo tiempo ha demostrado efectos negativos en el ensamblaje de las VLPs. El mismo concepto se ha aplicado en estudios en células de insecto, co-produciendo la proteína VP1 y las chaperonas bacterianas DnaK/DnaJ. En este caso el rendimiento de producción se ha visto afectado por la presencia de las chaperonas contrariamente a la calidad conformacional que se ha visto beneficiada. Paralelamente, estudios sobre las propiedad arquitectónicas de la proteína modular R9-GFP-H6 y sus interacciones con el ADN ha permitido establecer las condiciones optímales para la interacción de sus dominios peliotropicos, resultante en el auto ensamblado de esta proteína en complejos ADN/nanoparticulas capaces de proteger el ADN de la acción de proteasas. Además se ha propuesto un modelo bioinformática de las nanoestructuras estudiadas. Consecuentemente a la caracterización de la R9-GFP-H6, diferentes modelos de proteína modula auto-ensamblables derivada de esta han sido estudiados para evaluar sus eficacias a la hora de unir y transportar ADN al núcleo celular. En esta tesis se ha propuesto una modificación del protocolo de purificación que permite aumentar sensiblemente la eficacia de las diferentes nanoparticulas implicadas. Por lo tanto, en todos estos trabajos, queda reflejado que el desarrollo de virus artificiales para nanomedicina y terapia génica es un proceso fascinante y multidisciplinario donde las nanoparticulas de origen proteicos, sean proteínas modulares o virus like particles, están siendo concebidas como una herramienta extremadamente potente para la obtención de productos eficientes, seguros y comercialmente atractivos. Con esta tesis, entonces, se pretende entrar a fondo en las técnicas de desarrollo y mejora del proceso productivo de novedosas nanoestructuras proteicas para sus utilizo en nanomedicina.

The convergence of different field as biotechnology, molecular biology and genetic engineering in the development of a nano-scale therapeutical vector became matter of interest because of their nanomedical applications. The major challenge of nanovectors is obtain a good delivery of nucleic acid, therapeutic proteins or drugs, with high cell specificity and low side effects. In this way, viral vectors allow an extremely efficient delivery but are also responsible of severe side effects. Because of this main limitation, the development of artificial virus derived from either dendrimers, liposomes, polymers, modular proteins or virus like particles (VLPs) is considered an interesting and promising research field. In this thesis we expose our studies in the optimization of protein self-assembling nanoparticles. From one side we produced and characterized VLPs derived form the major capsid protein VP1 of the human JC virus both in E. coli and insect cells protein factories. On the other side we studied the optimization of the self-assembling and the purification process of multi-domain self-assembling proteins derived by paradigmatic protein R9-GFP-H6, which is described to form nanoparticles. Different genetic backgrounds for protein quality control system in E. coli have shown to alter the protein production yield and conformational quality of artificial virus assembly. We discuss in this thesis the effects of the prokaryotic DnaK chaperone on VP1 production yield and VLPs conformation quality. For this purpose we used three genetic backgrounds including, wild type expression, over-expression and absence of expression of DnaK molecular chaperone. Surprisingly, in the absence of the molecular chaperone the production yield of VP1 is enhanced but has negative effects on VLPs assembly. Moreover we tested different buffer formulations in order to establish the optimal salt concentration and pH for VLP organization, stabilization and conformation. The same concept where applied for insect cell system, exploring the effects in yield and conformational quality of VP1 hJCV VLPs upon re-hosting DnaK/DnaJ chaperones. Results showed a lowering in production yield upon chaperone co-expression but an increase in VLPs conformational quality. At the same time architectural properties of the paradigm protein R9-GFP-H6 and its interactions with DNA were studied in order to obtain a suitable protein-based artificial virus for gene delivery. It has been observed that in presence of DNA and at slightly acidic pH, R9-GFP-H6 proteins organize in two distinct populations. Microscopy observations showed a supramolecular organization of DNA/nanoparticle complexes, revealing the 9 Arginine and 6 Histidines blocks as promising pleyotropic domains. Moreover, in optimized conditions, R9-GFP-H6 protein has also showed an effective DNA protection against proteases. Finally, we purposed potential structural models of R9-GFP-H6/DNA complexes, based on bioinformatics analysis and experimental data. Subsequently we explored the nucleic acid contaminants in non-viral protein based nanovector production process of R9-GFP-H6 derivative proteins. Enzymatic downstream treatment with nucleases has revealed a good strategy to solve the limitations derived from nucleic acid contamination. All together, these works allows having a general overview of non-viral nanoparticles approach in gene delivery and permitting to understand better the difficulties in the production process. With this thesis, then, we claim to discuss and develop newly production and purification methods in order to develop efficient artificial virus for nanomedicine and gene therapy.