Model-based design and development of operational strategies for Rhizopus oryzae lipase production in Pichia pastoris under the AOX1 promoter

Abstract

Pichia pastoris es identificada como una de las factorías celulares más eficientes para la producción de proteínas recombinantes. Más de 500 proteínas han sido expresadas usando este sistema de expresión. P. pastoris combina la habilidad de crecer en medios mínimos a altas densidades celulares con la de secreción de proteína heteróloga, ayudando a su recuperación. En este trabajo, la proteína modelo seleccionada es la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae (ROL). La producción heteróloga de ROL en cultivos fed-bach de P. pastoris PAOX1 (Mut+) ha sido estudiada desde el punto de vista de la monitorización y control del bioproceso, la modelización cinética y el diseño y desarrollo de estrategias operacionales. El primer paso en la investigación ha sido la estimación de la concentración de biomasa, sustrato y velocidad específica de crecimiento (μ) mediante dos observadores no lineales y uno lineal. El objetivo de este estudio ha sido comparar las prestaciones de los diferentes algoritmos en bioproceso de P. pastoris. La producción de proteína recombinante está estrechamente relacionada con la μ. Por lo tanto, debido a su elevada relevancia en el bioproceso, μ fue estimada utilizando el análisis de los gases de salida en línea o las medidas de la concentración de sustrato. La biomasa y el sustrato fueron obtenidos directamente de sus correspondientes balances de materia. La estrategia de cultivo más frecuentemente utilizada para conseguir altas densidades celulares y elevada producción de proteína heteróloga con el sistema PAOX1 (Mut+) es la operación fed-batch. Las estrategias operacionales estándar están basadas en el control de la concentración de sustrato próximas a cero (estrategias limitantes) o manteniendo la concentración a un valor contante (estrategias no limitantes). En consecuencia se estudió el efecto de las estrategias operacionales fed-batch de metanol no limitante (MNLFB) y metanol limitante (MLFB) en la producción de ROL. Éstas son las estrategias de control más comunes que tienen como objetivo mantener contantes las velocidades específicas claves: crecimiento celular (μ), consumo de sustrato (qs) y producción de proteína (qp) a partir de la hipótesis de estado quasiestacionario para el sustrato. Los resultados se analizaron con el objetivo de determinar la condición más apropiada en función de rendimientos y productividades. Las velocidades específicas medias y las variables de estado para varios cultivos fedbatch, bajo condiciones de metanol limitante y no limitante, se usaron para el desarrollo de un modelo macrocinético no estructurado para la producción heteróloga de la ROL por el sistema P. pastoris PAOX1. Posteriormente, se ha realizado un metaanálisis comparativo sobre la producción de varias proteínas heterólogas modelo para P. pastoris bajo el promotor AOX1 y se ha desarrollado una estrategia general para mejorar la producción de proteínas a partir de la cinética como clave para la optimización del proceso. Adicionalmente se ha estudiado y caracterizado la capacidad de transferencia de oxigeno en diferentes biorreactores a escala laboratorio y piloto. El modelo de transferencia de oxigeno ha sido también desarrollado y validado en la producción de ROL en P. pastoris bajo el promotor AOX1. Finalmente, el modelo cinético previamente desarrollado para la producción heteróloga de ROL y el modelo de transferencia de oxigeno han sido aplicados para definir estrategias alternativas de operación basadas en operaciones con oxígeno limitante (OLFB) comparándose con las estrategias estándar.

Pichia pastoris is recognized as one of the most efficient cell factories for the production of recombinant proteins. More than 500 proteins have been expressed using this system. P. pastoris combines the ability of growing on minimal medium at very high cell densities with secreting the heterologous protein, aiding to their recovery. In this work, the selected target protein has been is the recombinant Rhizopus oryzae lipase (ROL). The heterologous ROL production in P. pastoris PAOX1 (Mut+) fed-batch cultures has been studied for bioprocess monitoring and control, kinetic modelling, and the design and development operational strategies. The first step in the research has been the estimation of biomass, substrate and specific growth rate (μ) by means of two non-linear observers and a linear estimator. The aim of this study has been to compare the performance of the different algorithms in P. pastoris bioprocesses. Heterologous protein production is closely related to μ. So, due to its high relevance in the bioprocess, μ has been estimated by on-line gas analyses or substrate concentration measurements. Biomass and substrate have been straightforwardly obtained solving their corresponding mass balances. The most frequently used cultivation strategy to achieve high cell densities and high heterologous protein production levels with PAOX1-(Mut+)-based system is the fedbatch operation. The standard operational strategies are based on the control of the substrate concentration close to zero (limiting strategies) or keeping the concentration at a constant value (non-limiting strategies). Consequently, the effect of methanol nonlimiting fed-batch (MNLFB) and methanol limited fed-batch (MLFB) operational strategies on ROL production has been studied. These most commonly applied control strategies allow maintaining rather constant key specific rates: cell growth (μ), substrate uptake (qs), and protein production (qp) through the quasi-steady state hypothesis for substrate. Results have been analyzed in order to determine the most suitable operating conditions in terms of yields and productivities. Furthermore, mean specific rates and state variables for various fed-batch cultures, under methanol limited and non-limited conditions were used for modeling. Hence, an unstructured macrokinetic model for heterologous ROL production by a P. pastoris PAOX1 based system has been developed. Then, a comparative meta-analysis of heterologous protein production of various target proteins by P. pastoris under AOX1 promoter has been conducted and a general strategy for improving protein production from process kinetics was developed as a key to bioprocess optimization. Additionally, the characterization of oxygen transfer capacity in different laboratory/pilot scale bioreactors has been studied. The oxygen transfer model was also developed and validated in heterologous ROL production by P. pastoris under AOX1 promoter. Finally, the previous kinetic model for heterologous ROL production and oxygen transfer model have been applied to define alternative operational strategies based on oxygen limited fed-batch operations (OLFB) and have been compared to the standard strategies.